تحليل الخلية الواحدة للتعبير عن جينات حقنة الزائفة داخل الأنسجة النباتية
Summary
يصف البروتوكول الحالي طريقة تسمح بتحليل التعبير الجيني أحادي الخلية على مجموعات محاقن Pseudomonas المزروعة داخل نبات apoplast.
Abstract
عدد كبير من الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض تهاجم النباتات باستمرار. يشمل مجمع أنواع Pseudomonas syringae البكتيريا المسببة للأمراض النباتية سالبة الجرام ذات الأهمية الخاصة لعدد كبير من المضيفين. تدخل P. syringae النبات من سطح الورقة وتتكاثر بسرعة داخل apoplast ، وتشكل مستعمرات دقيقة تشغل الفضاء بين الخلايا. يسمح التعبير التأسيسي للبروتينات الفلورية بواسطة البكتيريا بتصور المستعمرات الدقيقة ومراقبة تطور العدوى على المستوى المجهري. كشفت التطورات الحديثة في تحليل الخلية الواحدة عن التعقيد الكبير الذي وصلت إليه مجموعات البكتيريا المتجانسة المولدة للتنسيج. هذا التعقيد ، الذي يشار إليه باسم عدم التجانس الظاهري ، هو نتيجة للاختلافات من خلية إلى أخرى في التعبير الجيني (غير المرتبط بالاختلافات الجينية) بين المجتمع البكتيري. لتحليل التعبير عن المواقع الفردية على مستوى الخلية الواحدة ، تم استخدام عمليات الاندماج النسخية للبروتينات الفلورية على نطاق واسع. في ظل ظروف الإجهاد ، مثل تلك التي تحدث أثناء استعمار نبات apoplast ، تتمايز P. syringae إلى مجموعات فرعية متميزة بناء على التعبير غير المتجانس لجينات الفوعة الرئيسية (أي نظام إفراز Hrp من النوع الثالث). ومع ذلك ، فإن تحليل الخلية الواحدة لأي مجموعة معينة من P. syringae المستعادة من الأنسجة النباتية يمثل تحديا بسبب الحطام الخلوي المنبعث أثناء الاضطراب الميكانيكي الجوهري لعمليات التلقيح والاستخراج البكتيري. ويفصل هذا التقرير طريقة وضعت لرصد التعبير عن جينات P. syringae ذات الأهمية على مستوى الخلية الواحدة أثناء استعمار نبات الأرابيدوبسيس والفاصوليا. يتم وصف تحضير النباتات والمعلقات البكتيرية المستخدمة للتلقيح باستخدام غرفة مفرغة. كما يتم شرح تعافي البكتيريا الداخلية من الأوراق المصابة عن طريق استخراج السوائل apoplastic هنا. تم تحسين كل من طرق التلقيح البكتيري والاستخراج البكتيري تجريبيا لتقليل تلف الخلايا النباتية والبكتيرية ، مما أدى إلى الاستعدادات البكتيرية المثلى للفحص المجهري وتحليل التدفق الخلوي.
Introduction
تظهر البكتيريا المسببة للأمراض اختلافات في الأنماط الظاهرية المتنوعة ، مما يؤدي إلى تكوين مجموعات فرعية داخل مجموعات متطابقة وراثيا. تعرف هذه الظاهرة باسم عدم التجانس الظاهري وقد تم اقتراحها كاستراتيجية تكيف أثناء التفاعلات بين البكتيرياوالمضيف 1. عززت التطورات الحديثة في الدقة البصرية للمجاهر متحدة البؤر ، وقياس التدفق الخلوي ، والموائع الدقيقة ، جنبا إلى جنب مع البروتينات الفلورية ، تحليلات الخلية الواحدة لمجموعات البكتيريا2.
حقنة Pseudomonas سالبة الجرام هي بكتيريا ممرضة نباتية نموذجية نظرا لأهميتها الأكاديمية والاقتصادية3. ترتبط دورة حياة P. syringae بدورة المياه4. تدخل P. syringae إلى الفراغات بين الخلايا بين خلايا الميزوفيل ، وهي أبوبلاست أوراق النبات ، من خلال فتحات طبيعية مثل الثغور أو الجروح5. بمجرد دخول P. syringae إلى apoplast ، يعتمد على نظام إفراز النوع الثالث (T3SS) والمستجيبات المنقولة من النوع الثالث (T3E) لقمع مناعة النبات والتعامل مع الوظائف الخلوية للنبات لصالح العامل الممرض6. يعتمد التعبير عن T3SS و T3E على المنظم الرئيسي HrpL ، وهو عامل سيجما بديل يرتبط بزخارف صندوق hrp في منطقة المروج للجينات المستهدفة7.
من خلال توليد اندماجات نسخية موجودة بالكروموسوم إلى جينات البروتين الفلوري في اتجاه مجرى الجين محل الاهتمام ، يمكن للمرء مراقبة التعبير الجيني بناء على مستويات التألق المنبعثة على مستوى الخليةالواحدة 8. باستخدام هذه الطريقة ، ثبت أن التعبير عن hrpL غير متجانس داخل كل من الثقافات البكتيرية المزروعة في المختبر وداخل المجموعات البكتيرية المستعادة من نبات apoplast 8,9. على الرغم من أن تحليل التعبير الجيني على مستوى الخلية الواحدة يتم إجراؤه عادة في المزارع البكتيرية المزروعة في الوسائط المختبرية ، إلا أنه يمكن أيضا إجراء مثل هذه التحليلات على المجموعات البكتيرية التي تنمو داخل النبات ، وبالتالي توفير معلومات قيمة عن تكوين مجموعات فرعية في السياق الطبيعي. أحد القيود المحتملة لتحليل المجموعات البكتيرية المستخرجة من النبات هو أن طرق التلقيح الكلاسيكية عن طريق تسلل ضغط الحقن إلى الأبوبلاست ، يليها الاستخراج البكتيري عن طريق نقع أنسجة الأوراق ، عادة ما تولد كمية كبيرة من حطام النبات الخلوي الذي يتداخل مع تحليل المصب10. يتكون معظم الحطام الخلوي من شظايا الفلورسنت الذاتي من البلاستيدات الخضراء التي تتداخل مع مضان GFP ، مما يؤدي إلى نتائج مضللة.
يصف البروتوكول الحالي عملية تحليل عدم تجانس التعبير الجيني أحادي الخلية في نظامين مرضيين نموذجيين: النظام الذي تشكله P. syringae pv. سلالة الطماطم DC3000 و Arabidopsis thaliana (Col-0) ، والآخر بواسطة P. syringae الكهروضوئية. سلالة فاسوليكولا 1448A ونباتات الفاصوليا (صنف Phaseolus vulgaris الكندي العجائب). يقترح طريقة التلقيح على أساس التسلل الفراغي باستخدام غرفة فراغ ومضخة ، مما يؤدي إلى طريقة سريعة وخالية من التلف للتسلل إلى الأوراق الكاملة. علاوة على ذلك ، كتحسين للبروتوكولات التقليدية ، يتم استخدام طريقة ألطف لاستخراج البكتيريا من apoplast التي تقلل بشكل كبير من اضطراب الأنسجة ، بناء على استخراج السائل apoplastic عن طريق تطبيق دورات من الضغط الإيجابي والسلبي باستخدام كمية صغيرة من الحجم داخل حقنة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف الطريقة المعروضة هنا إجراء غير جراحي يسمح بتسلل البكتيريا إلى الأنسجة الورقية النباتية ، مما يسمح بالتلقيح السريع لكميات كبيرة مع تقليل اضطراب الأنسجة. واحدة من خصائص مجمع أنواع P. syringae هي القدرة على البقاء والتكاثر داخل apoplast النبات وعلى سطح النبات كما epiphyte14. وبالتال…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منحة المشروع RTI2018-095069-B-I00 بتمويل من MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 / ومن قبل “ERDP طريقة لصنع أوروبا”. تم تمويل JSR من قبل خطة Andaluz de Investigación و Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). تم تمويل N.L.P. من خلال منحة المشروع P18-RT-2398 من خطة Andaluz de Investigación و Desarrollo e Innovación.
Materials
| 0.17 mm coverslip | No special requirements | ||
| 1.6 x 1.6 mm metal mesh | Buzifu | Fiberglass screen mesh | |
| 10 cm diameter pots | No special requirements | ||
| 140 mm Petri dishes | No special requirements | ||
| 20 mL syringe | No special requirements | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Agarose | Merk | ||
| Ampicillin sodium | GoldBio | ||
| Bacteriological agar | Roko | ||
| Confocal Microscope Stellaris | Leica Microsystems | ||
| FACSVerse cell analyzer | BD Biosciences | ||
| Fiji software | |||
| Gentamycin sulfate | Duchefa | G-0124 | |
| Kanamycin monosulfate | Phytotechnology | K378 | |
| MgCl2 | Merk | ||
| NaCl | Merk | ||
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | ||
| Plant substrate | No special requirements | ||
| Silwet L-77 | Cromton Europe Ltd | ||
| Toothpicks | No special requirements | ||
| Tryptone | Merk | ||
| Tweezers | No special requirements | ||
| Vacuum chamber 25 cm diameter | Kartell | 554 | |
| Vacuum pump | GAST | DOA-P504-BN | |
| Vermiculite | No special requirements | ||
| Yeast Extract | Merk |
Riferimenti
- Weigel, W. A., Dersch, P. Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy. Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).
- Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters. Microorganisms. 9 (11), 2277 (2021).
- Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (6), 614-629 (2012).
- Morris, C. E., et al. The life history of the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle. The ISME Journal. 2 (3), 321-334 (2008).
- Rufián, J. S., et al. Confocal microscopy reveals in planta dynamic interactions between pathogenic, avirulent and non-pathogenic Pseudomonas syringae strains. Molecular Plant Pathology. 19 (3), 537-551 (2018).
- Macho, A. P. Subversion of plant cellular functions by bacterial type-III effectors: Beyond suppression of immunity. New Phytologist. 210 (1), 51-57 (2016).
- Xiao, Y., Hutcheson, S. W. A single promoter sequence recognized by a newly identified alternate sigma factor directs expression of pathogenicity and host range determinants in Pseudomonas syringae. Journal of Bacteriology. 176 (10), 3089-3091 (1994).
- Rufián, J. S., et al. Generating chromosome-located transcriptional fusions to fluorescent proteins for single-cell gene expression analysis in Pseudomonas syringae. Methods in Molecular Biology. 1734, 183-199 (2018).
- Rufian, J. S., et al. Pseudomonas syringae differentiates into phenotypically distinct subpopulations during colonization of a plant host. Environmental Microbiology. 18 (10), 3593-3605 (2016).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. Arabidopsis Book. 1, 0039 (2002).
- Fouts, D. E., et al. Genomewide identification of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 promoters controlled by the HrpL alternative sigma factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2275-2280 (2002).
- Huber, P. J. . Robust Statistics. , (1981).
- Freed, N. E., et al. A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise. PLoS Genetics. 4 (12), 1000307 (2008).
- Hirano, S. S., Upper, C. D. Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).
- Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. J. Roadmap to new virulence determinants in Pseudomonas syringae: Insights from comparative genomics and genome organization. Molecular Plant Microbe Interactions. 21 (6), 685-700 (2008).
- Liu, X., et al. Bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (104), e53364 (2015).
- O’Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using Phaseolus vulgaris as an example. Journal of Visualized Experiments. (94), e52113 (2014).
- Tornero, P., Dangl, J. L. A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).
