Enkeltcelleanalyse af ekspressionen af Pseudomonas syringae-gener i plantevævet
Summary
Denne protokol beskriver en metode, der tillader enkeltcelle genekspressionsanalyse på Pseudomonas syringae-populationer dyrket inden for planteapoplasten.
Abstract
En overflod af patogene mikroorganismer angriber konstant planter. Pseudomonas syringae-artskomplekset omfatter gramnegative plantepatogene bakterier af særlig relevans for et stort antal værter. P. syringae kommer ind i planten fra bladoverfladen og multiplicerer hurtigt inden for apoplasten og danner mikrokolonier, der optager det intercellulære rum. Bakteriernes konstitutive ekspression af fluorescerende proteiner muliggør visualisering af mikrokolonierne og overvågning af infektionens udvikling på mikroskopisk niveau. Nylige fremskridt inden for enkeltcelleanalyse har afsløret den store kompleksitet, som klonale isogene bakteriepopulationer når frem til. Denne kompleksitet, kaldet fænotypisk heterogenitet, er konsekvensen af celle-til-celle forskelle i genekspression (ikke knyttet til genetiske forskelle) blandt bakteriesamfundet. For at analysere ekspressionen af individuelle loci på enkeltcelleniveau er transkriptionelle fusioner til fluorescerende proteiner blevet anvendt i vid udstrækning. Under stressforhold, såsom dem, der forekommer under kolonisering af planteapoplasten, differentierer P. syringae sig i forskellige subpopulationer baseret på den heterogene ekspression af nøglevirulensgener (dvs. Hrp type III-sekretionssystemet). Imidlertid er enkeltcelleanalyse af en given P. syringae-population , der er genvundet fra plantevæv, udfordrende på grund af det cellulære affald, der frigives under den mekaniske forstyrrelse, der er iboende i podnings- og bakterieekstraktionsprocesserne. Denne rapport beskriver en metode udviklet til at overvåge ekspressionen af P. syringae-gener af interesse på enkeltcelleniveau under koloniseringen af Arabidopsis og bønneplanter. Fremstillingen af planterne og de bakteriesuspensioner, der anvendes til podning ved hjælp af et vakuumkammer, er beskrevet. Genoprettelsen af endofytiske bakterier fra inficerede blade ved apoplastisk væskeekstraktion forklares også her. Både bakteriepodnings- og bakterieekstraktionsmetoderne er empirisk optimeret for at minimere plante- og bakteriecelleskader, hvilket resulterer i bakterielle præparater, der er optimale til mikroskopi og flowcytometrianalyse.
Introduction
Patogene bakterier udviser forskelle i forskellige fænotyper, hvilket giver anledning til dannelse af subpopulationer inden for genetisk identiske populationer. Dette fænomen er kendt som fænotypisk heterogenitet og er blevet foreslået som en tilpasningsstrategi under bakterie-værtsinteraktioner1. Nylige fremskridt inden for den optiske opløsning af konfokale mikroskoper, flowcytometri og mikrofluidik kombineret med fluorescerende proteiner har fremmet enkeltcelleanalyser af bakteriepopulationer2.
Den gramnegative Pseudomonas syringae er en arketypisk plantepatogen bakterie på grund af både dens akademiske og økonomiske betydning3. Livscyklussen for P. syringae er knyttet til vandcyklussen4. P. syringae kommer ind i de intercellulære rum mellem mesofylcellerne, plantebladets apoplast, gennem naturlige åbninger såsom stomata eller sår5. En gang inden for apoplasten er P. syringae afhængig af type III-sekretionssystemet (T3SS) og de type III-translokerede effektorer (T3E) for at undertrykke planteimmunitet og manipulere plantecellulære funktioner til gavn for patogenet6. Ekspressionen af T3SS og T3E afhænger af masterregulatoren HrpL, en alternativ sigmafaktor, der binder til hrp-box-motiverne i promotorregionen af målgenerne7.
Ved at generere kromosomlokaliserede transkriptionelle fusioner til fluorescerende proteingener nedstrøms for genet af interesse, kan man overvåge genekspression baseret på fluorescensniveauerne udsendt på enkeltcelleniveau8. Ved hjælp af denne metode er det blevet fastslået, at ekspressionen af hrpL er heterogen både inden for bakteriekulturer dyrket i laboratoriet og inden for bakteriepopulationer genvundet fra planten apoplast 8,9. Selvom genekspressionsanalyse på enkeltcelleniveau typisk udføres i bakteriekulturer dyrket i laboratoriemedier, kan sådanne analyser også udføres på bakteriepopulationer, der vokser i planten, hvilket giver værdifuld information om dannelsen af subpopulationer i den naturlige sammenhæng. En potentiel begrænsning for analysen af bakteriepopulationer ekstraheret fra planten er, at klassiske podningsmetoder ved sprøjtetrykinfiltration i apoplasten efterfulgt af bakterieekstraktion ved maceration af bladvævet typisk genererer en stor mængde cellulært planteaffald, der forstyrrer nedstrømsanalyse10. De fleste cellulære affald består af autofluorescerende fragmenter af kloroplaster, der overlapper GFP-fluorescens, hvilket resulterer i vildledende resultater.
Denne protokol beskriver processen med at analysere enkeltcelle genekspressionsheterogenitet i to modelpatosystemer: den dannet af P. syringae pv. tomatstamme DC3000 og Arabidopsis thaliana (Col-0), og den anden af P. syringae pv. phaseolicola stamme 1448A og bønneplanter (Phaseolus vulgaris cultivar Canadian Wonder). Der foreslås en podningsmetode baseret på vakuuminfiltration ved hjælp af et vakuumkammer og en pumpe, hvilket resulterer i en hurtig og skadefri metode til at infiltrere hele blade. Som en forbedring af konventionelle protokoller anvendes desuden en blidere metode til at ekstrahere bakteriepopulationen fra apoplasten, der signifikant reducerer vævsforstyrrelse, baseret på ekstraktion af apoplastisk væske ved at anvende cyklusser med positivt og negativt tryk ved hjælp af en lille mængde volumen i en sprøjte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden, der præsenteres her, beskriver en ikke-invasiv procedure, der tillader infiltration af bakterier i plantens bladvæv, hvilket muliggør hurtig podning af store mængder, samtidig med at vævsforstyrrelse minimeres. Et af kendetegnene ved P. syringae-artskomplekset er evnen til at overleve og sprede sig inde i planteapoplasten og på planteoverfladen som epifyt14. Således kan muligheden for, at bakterierne ekstraheret ved hjælp af denne protokol kun kommer fra planteapoplasten,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af projekttilskud RTI2018-095069-B-I00 finansieret af MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ og af “ERDP: A way of making Europe”. J.S.R. blev finansieret af Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). N.L.P. blev finansieret af Project Grant P18-RT-2398 fra Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.
Materials
| 0.17 mm coverslip | No special requirements | ||
| 1.6 x 1.6 mm metal mesh | Buzifu | Fiberglass screen mesh | |
| 10 cm diameter pots | No special requirements | ||
| 140 mm Petri dishes | No special requirements | ||
| 20 mL syringe | No special requirements | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Agarose | Merk | ||
| Ampicillin sodium | GoldBio | ||
| Bacteriological agar | Roko | ||
| Confocal Microscope Stellaris | Leica Microsystems | ||
| FACSVerse cell analyzer | BD Biosciences | ||
| Fiji software | |||
| Gentamycin sulfate | Duchefa | G-0124 | |
| Kanamycin monosulfate | Phytotechnology | K378 | |
| MgCl2 | Merk | ||
| NaCl | Merk | ||
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | ||
| Plant substrate | No special requirements | ||
| Silwet L-77 | Cromton Europe Ltd | ||
| Toothpicks | No special requirements | ||
| Tryptone | Merk | ||
| Tweezers | No special requirements | ||
| Vacuum chamber 25 cm diameter | Kartell | 554 | |
| Vacuum pump | GAST | DOA-P504-BN | |
| Vermiculite | No special requirements | ||
| Yeast Extract | Merk |
Riferimenti
- Weigel, W. A., Dersch, P. Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy. Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).
- Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters. Microorganisms. 9 (11), 2277 (2021).
- Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (6), 614-629 (2012).
- Morris, C. E., et al. The life history of the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle. The ISME Journal. 2 (3), 321-334 (2008).
- Rufián, J. S., et al. Confocal microscopy reveals in planta dynamic interactions between pathogenic, avirulent and non-pathogenic Pseudomonas syringae strains. Molecular Plant Pathology. 19 (3), 537-551 (2018).
- Macho, A. P. Subversion of plant cellular functions by bacterial type-III effectors: Beyond suppression of immunity. New Phytologist. 210 (1), 51-57 (2016).
- Xiao, Y., Hutcheson, S. W. A single promoter sequence recognized by a newly identified alternate sigma factor directs expression of pathogenicity and host range determinants in Pseudomonas syringae. Journal of Bacteriology. 176 (10), 3089-3091 (1994).
- Rufián, J. S., et al. Generating chromosome-located transcriptional fusions to fluorescent proteins for single-cell gene expression analysis in Pseudomonas syringae. Methods in Molecular Biology. 1734, 183-199 (2018).
- Rufian, J. S., et al. Pseudomonas syringae differentiates into phenotypically distinct subpopulations during colonization of a plant host. Environmental Microbiology. 18 (10), 3593-3605 (2016).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. Arabidopsis Book. 1, 0039 (2002).
- Fouts, D. E., et al. Genomewide identification of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 promoters controlled by the HrpL alternative sigma factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2275-2280 (2002).
- Huber, P. J. . Robust Statistics. , (1981).
- Freed, N. E., et al. A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise. PLoS Genetics. 4 (12), 1000307 (2008).
- Hirano, S. S., Upper, C. D. Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).
- Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. J. Roadmap to new virulence determinants in Pseudomonas syringae: Insights from comparative genomics and genome organization. Molecular Plant Microbe Interactions. 21 (6), 685-700 (2008).
- Liu, X., et al. Bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (104), e53364 (2015).
- O’Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using Phaseolus vulgaris as an example. Journal of Visualized Experiments. (94), e52113 (2014).
- Tornero, P., Dangl, J. L. A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).
