Enkeltcelleanalyse av ekspresjonen av Pseudomonas syringae-gener i plantevevet
Summary
Den nåværende protokollen beskriver en metode som tillater enkeltcellegenuttrykksanalyse på Pseudomonas syringae-populasjoner dyrket i planten apoplast.
Abstract
En mengde patogene mikroorganismer angriper stadig planter. Artskomplekset Pseudomonas syringae omfatter gramnegative plantepatogene bakterier av spesiell relevans for et stort antall verter. P. syringae kommer inn i planten fra bladoverflaten og multipliserer raskt i apoplasten, og danner mikrokolonier som opptar det intercellulære rommet. Det konstitutive uttrykket av fluorescerende proteiner av bakteriene muliggjør visualisering av mikrokoloniene og overvåking av utviklingen av infeksjonen på mikroskopisk nivå. Nylige fremskritt innen enkeltcelleanalyse har avslørt den store kompleksiteten som nås av klonale isogene bakteriepopulasjoner. Denne kompleksiteten, referert til som fenotypisk heterogenitet, er konsekvensen av celle-til-celle-forskjeller i genuttrykk (ikke knyttet til genetiske forskjeller) blant bakteriesamfunnet. For å analysere uttrykket av individuelle loci på enkeltcellenivå, har transkripsjonsfusjoner til fluorescerende proteiner blitt mye brukt. Under stressforhold, som de som oppstår under kolonisering av planteapoplasten, skiller P. syringae seg ut i forskjellige subpopulasjoner basert på det heterogene uttrykket av viktige virulensgener (dvs. Hrp type III sekresjonssystem). Imidlertid er enkeltcelleanalyse av en gitt P. syringae-populasjon gjenvunnet fra plantevev utfordrende på grunn av det cellulære rusket som frigjøres under den mekaniske forstyrrelsen som er iboende for inokulasjons- og bakterieekstraksjonsprosessene. Denne rapporten beskriver en metode utviklet for å overvåke ekspresjonen av P. syringae-gener av interesse på enkeltcellenivå under koloniseringen av Arabidopsis og bønneplanter. Fremstillingen av plantene og bakterielle suspensjoner som brukes til inokulering ved hjelp av et vakuumkammer er beskrevet. Utvinningen av endofytiske bakterier fra infiserte blader ved apoplastisk væskeekstraksjon er også forklart her. Både bakteriell inokulasjon og bakteriell ekstraksjonsmetoder er empirisk optimalisert for å minimere plante- og bakteriell celleskade, noe som resulterer i bakterielle preparater som er optimale for mikroskopi og flowcytometrianalyse.
Introduction
Patogene bakterier viser forskjeller i forskjellige fenotyper, noe som gir opphav til dannelse av underpopulasjoner innenfor genetisk identiske populasjoner. Dette fenomenet er kjent som fenotypisk heterogenitet og har blitt foreslått som en tilpasningsstrategi under bakterie-vert-interaksjoner1. Nylige fremskritt i optisk oppløsning av konfokale mikroskoper, flowcytometri og mikrofluidikk, kombinert med fluorescerende proteiner, har fostret enkeltcelleanalyser av bakteriepopulasjoner2.
Den gramnegative Pseudomonas syringae er en arketypisk plantepatogen bakterie på grunn av både dens faglige og økonomiske betydning3. Livssyklusen til P. syringae er knyttet til vannets kretsløp4. P. syringae kommer inn i de intercellulære mellomrommene mellom mesofyllcellene, plantebladapoplasten, gjennom naturlige åpninger som stomata eller sår5. En gang i apoplasten er P. syringae avhengig av type III-sekresjonssystemet (T3SS) og type III-translokerte effektorer (T3E) for å undertrykke planteimmunitet og manipulere plantecellulære funksjoner til fordel for patogenet6. Uttrykket av T3SS og T3E avhenger av masterregulatoren HrpL, en alternativ sigmafaktor som binder seg til hrp-boksmotivene i promotorregionen til målgenene7.
Ved å generere kromosomlokaliserte transkripsjonsfusjoner til fluorescerende proteingener nedstrøms for genet av interesse, kan man overvåke genuttrykk basert på fluorescensnivåene som sendes ut på enkeltcellenivå8. Ved hjelp av denne metoden har det blitt fastslått at uttrykket av hrpL er heterogent både innenfor bakteriekulturer dyrket i laboratoriet og innenfor bakteriepopulasjoner gjenvunnet fra planten apoplast 8,9. Selv om genekspresjonsanalyse på enkeltcellenivå vanligvis utføres i bakteriekulturer dyrket i laboratoriemedier, kan slike analyser også utføres på bakteriepopulasjoner som vokser i planten, og gir dermed verdifull informasjon om dannelsen av underpopulasjoner i naturlig sammenheng. En potensiell begrensning for analysen av bakteriepopulasjoner ekstrahert fra planten er at klassiske inokulasjonsmetoder ved sprøytetrykkinfiltrasjon i apoplasten, etterfulgt av bakteriell ekstraksjon ved maserasjon av bladvevet, vanligvis genererer en stor mengde cellulært planteavfall som forstyrrer nedstrømsanalyse10. De fleste cellulære rusk består av autofluorescerende fragmenter av kloroplaster som overlapper med GFP-fluorescens, noe som resulterer i misvisende resultater.
Den foreliggende protokollen beskriver prosessen med å analysere encellet genuttrykksheterogenitet i to modellpatosystemer: den som dannes av P. syringae pv. tomatstamme DC3000 og Arabidopsis thaliana (Col-0), og den andre av P. syringae pv. phaseolicola stamme 1448A og bønneplanter (Phaseolus vulgaris cultivar Canadian Wonder). En inokulasjonsmetode foreslås basert på vakuuminfiltrasjon ved hjelp av et vakuumkammer og en pumpe, noe som resulterer i en rask og skadefri metode for å infiltrere hele blader. Videre, som en forbedring av konvensjonelle protokoller, brukes en mildere metode for å trekke ut bakteriepopulasjonen fra apoplasten som signifikant reduserer vevsforstyrrelser, basert på ekstraksjon av apoplastisk væske ved å anvende sykluser med positivt og negativt trykk ved hjelp av en liten mengde volum i en sprøyte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden som presenteres her beskriver en ikke-invasiv prosedyre som tillater infiltrering av bakterier i plantebladvevet, noe som muliggjør rask inokulering av store volumer samtidig som vevsforstyrrelser minimeres. Et av egenskapene til P. syringae-artskomplekset er evnen til å overleve og proliferere inne i planteapoplasten og på planteoverflaten som epifyt14. Dermed kan muligheten for at bakteriene ekstrahert ved hjelp av denne protokollen bare kommer fra planten apoplast ikke utelu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Project Grant RTI2018-095069-B-I00 finansiert av MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ og av “ERDP A way of making Europe”. J.S.R. ble finansiert av Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). N.L.P. ble finansiert av Project Grant P18-RT-2398 fra Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.
Materials
| 0.17 mm coverslip | No special requirements | ||
| 1.6 x 1.6 mm metal mesh | Buzifu | Fiberglass screen mesh | |
| 10 cm diameter pots | No special requirements | ||
| 140 mm Petri dishes | No special requirements | ||
| 20 mL syringe | No special requirements | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Agarose | Merk | ||
| Ampicillin sodium | GoldBio | ||
| Bacteriological agar | Roko | ||
| Confocal Microscope Stellaris | Leica Microsystems | ||
| FACSVerse cell analyzer | BD Biosciences | ||
| Fiji software | |||
| Gentamycin sulfate | Duchefa | G-0124 | |
| Kanamycin monosulfate | Phytotechnology | K378 | |
| MgCl2 | Merk | ||
| NaCl | Merk | ||
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | ||
| Plant substrate | No special requirements | ||
| Silwet L-77 | Cromton Europe Ltd | ||
| Toothpicks | No special requirements | ||
| Tryptone | Merk | ||
| Tweezers | No special requirements | ||
| Vacuum chamber 25 cm diameter | Kartell | 554 | |
| Vacuum pump | GAST | DOA-P504-BN | |
| Vermiculite | No special requirements | ||
| Yeast Extract | Merk |
Riferimenti
- Weigel, W. A., Dersch, P. Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy. Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).
- Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters. Microorganisms. 9 (11), 2277 (2021).
- Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (6), 614-629 (2012).
- Morris, C. E., et al. The life history of the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle. The ISME Journal. 2 (3), 321-334 (2008).
- Rufián, J. S., et al. Confocal microscopy reveals in planta dynamic interactions between pathogenic, avirulent and non-pathogenic Pseudomonas syringae strains. Molecular Plant Pathology. 19 (3), 537-551 (2018).
- Macho, A. P. Subversion of plant cellular functions by bacterial type-III effectors: Beyond suppression of immunity. New Phytologist. 210 (1), 51-57 (2016).
- Xiao, Y., Hutcheson, S. W. A single promoter sequence recognized by a newly identified alternate sigma factor directs expression of pathogenicity and host range determinants in Pseudomonas syringae. Journal of Bacteriology. 176 (10), 3089-3091 (1994).
- Rufián, J. S., et al. Generating chromosome-located transcriptional fusions to fluorescent proteins for single-cell gene expression analysis in Pseudomonas syringae. Methods in Molecular Biology. 1734, 183-199 (2018).
- Rufian, J. S., et al. Pseudomonas syringae differentiates into phenotypically distinct subpopulations during colonization of a plant host. Environmental Microbiology. 18 (10), 3593-3605 (2016).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. Arabidopsis Book. 1, 0039 (2002).
- Fouts, D. E., et al. Genomewide identification of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 promoters controlled by the HrpL alternative sigma factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2275-2280 (2002).
- Huber, P. J. . Robust Statistics. , (1981).
- Freed, N. E., et al. A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise. PLoS Genetics. 4 (12), 1000307 (2008).
- Hirano, S. S., Upper, C. D. Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).
- Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. J. Roadmap to new virulence determinants in Pseudomonas syringae: Insights from comparative genomics and genome organization. Molecular Plant Microbe Interactions. 21 (6), 685-700 (2008).
- Liu, X., et al. Bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (104), e53364 (2015).
- O’Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using Phaseolus vulgaris as an example. Journal of Visualized Experiments. (94), e52113 (2014).
- Tornero, P., Dangl, J. L. A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).
