Análise Unicelular da Expressão de Genes de Seringas de Pseudomonas syringae no Tecido Vegetal
Summary
O presente protocolo descreve um método que permite a análise da expressão gênica unicelular em populações de Pseudomonas syringae cultivadas dentro do apoplasto vegetal.
Abstract
Uma infinidade de microrganismos patogênicos atacam constantemente as plantas. O complexo de espécies de Pseudomonas syringae engloba bactérias Gram-negativas fitopatogênicas de especial relevância para um grande número de hospedeiros. P. syringae entra na planta pela superfície foliar e se multiplica rapidamente dentro do apoplasto, formando microcolônias que ocupam o espaço intercelular. A expressão constitutiva de proteínas fluorescentes pelas bactérias permite a visualização das microcolônias e o monitoramento do desenvolvimento da infecção em nível microscópico. Avanços recentes na análise unicelular têm revelado a grande complexidade alcançada pelas populações clonais isogênicas de bactérias. Essa complexidade, chamada de heterogeneidade fenotípica, é consequência de diferenças célula a célula na expressão gênica (não ligadas a diferenças genéticas) entre a comunidade bacteriana. Para analisar a expressão de loci individuais em nível unicelular, fusões transcricionais a proteínas fluorescentes têm sido amplamente utilizadas. Sob condições de estresse, como as que ocorrem durante a colonização do apoplasto vegetal, P. syringae diferencia-se em subpopulações distintas com base na expressão heterogênea de genes-chave de virulência (i.e., o sistema de secreção Hrp tipo III). No entanto, a análise de célula única de qualquer população de P. syringae recuperada do tecido vegetal é desafiadora devido aos detritos celulares liberados durante a ruptura mecânica intrínseca aos processos de inoculação e extração bacteriana. O presente relato detalha um método desenvolvido para monitorar a expressão de genes de interesse de P. syringae em nível unicelular durante a colonização de Arabidopsis e feijoeiro. A preparação das plantas e as suspensões bacterianas utilizadas para inoculação em câmara de vácuo são descritas. A recuperação de bactérias endofíticas de folhas infectadas por extração com fluido apoplásico também é explicada aqui. Tanto a inoculação bacteriana quanto os métodos de extração bacteriana são empiricamente otimizados para minimizar danos às células vegetais e bacterianas, resultando em preparações bacterianas ideais para análise de microscopia e citometria de fluxo.
Introduction
Bactérias patogênicas apresentam diferenças em fenótipos diversos, dando origem à formação de subpopulações dentro de populações geneticamente idênticas. Esse fenômeno é conhecido como heterogeneidade fenotípica e tem sido proposto como estratégia de adaptação durante interações bactéria-hospedeiro1. Avanços recentes na resolução óptica de microscópios confocais, citometria de fluxo e microfluídica, combinados com proteínas fluorescentes, têm fomentado análises unicelulares de populações bacterianas2.
A Pseudomonas syringae Gram-negativa é uma bactéria fitopatogênica arquetípica devido à sua importância acadêmica e econômica3. O ciclo de vida de P. syringae está ligado ao ciclo da água4. A P. syringae adentra os espaços intercelulares entre as células do mesofilo, o apoplasto foliar da planta, através de aberturas naturais como estômatos ou feridas5. Uma vez dentro do apoplasto, P. syringae depende do sistema de secreção tipo III (T3SS) e dos efetores translocados tipo III (T3E) para suprimir a imunidade vegetal e manipular as funções celulares das plantas em benefício do patógeno6. A expressão de T3SS e T3E depende do regulador mestre HrpL, um fator sigma alternativo que se liga aos motivos hrp-box na região promotora dos genes alvo7.
Ao gerar fusões transcricionais localizadas no cromossomo com genes de proteínas fluorescentes a jusante do gene de interesse, pode-se monitorar a expressão gênica com base nos níveis de fluorescência emitidos em nível de célula única8. Usando este método, estabeleceu-se que a expressão de hrpL é heterogênea tanto dentro de culturas bacterianas cultivadas em laboratório quanto dentro de populações bacterianas recuperadas do apoplasto vegetal 8,9. Embora a análise da expressão gênica em nível unicelular seja tipicamente realizada em culturas bacterianas cultivadas em meios de laboratório, tais análises também podem ser realizadas em populações bacterianas que crescem dentro da planta, fornecendo informações valiosas sobre a formação de subpopulações no contexto natural. Uma limitação potencial para a análise de populações bacterianas extraídas da planta é que os métodos clássicos de inoculação por infiltração por pressão de seringa no apoplasto, seguida de extração bacteriana por maceração do tecido foliar, tipicamente geram uma grande quantidade de restos celulares vegetais que interferem na análise a jusante10. A maioria dos debris celulares consiste em fragmentos autofluorescentes de cloroplastos que se sobrepõem à fluorescência da GFP, resultando em resultados enganosos.
O presente protocolo descreve o processo de análise da heterogeneidade da expressão gênica unicelular em dois fisiossistemas modelo: o formado por P. syringae pv. tomateiro cepa DC3000 e Arabidopsis thaliana (Col-0), e a outra pelo P. syringae pv. phaseolicola cepa 1448A e plantas de feijão (cultivar Phaseolus vulgaris Canadian Wonder). Um método de inoculação é proposto baseado na infiltração a vácuo usando uma câmara de vácuo e uma bomba, resultando em um método rápido e livre de danos para infiltração de folhas inteiras. Além disso, como um aprimoramento dos protocolos convencionais, um método mais suave é usado para extrair a população bacteriana do apoplasto que reduz significativamente a ruptura tecidual, baseado na extração de fluido apoplástico através da aplicação de ciclos de pressão positiva e negativa usando uma pequena quantidade de volume dentro de uma seringa.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método aqui apresentado descreve um procedimento não invasivo que permite a infiltração de bactérias no tecido foliar da planta, permitindo a inoculação rápida de grandes volumes e minimizando a ruptura tecidual. Uma das características do complexo de espécies de P. syringae é a capacidade de sobreviver e proliferar no interior do apoplasto vegetal e na superfície da planta como epífita14. Assim, não se pode descartar a possibilidade de que as bactérias extraídas pelo pr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Projeto Grant RTI2018-095069-B-I00 financiado pelo MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ e pelo “ERDP A way of making Europe”. O J.S.R. foi financiado pelo Plano Andaluz de Investigação, Desenvolvimento e Inovação (PAIDI 2020). N.L.P. foi financiado pelo Projeto Grant P18-RT-2398 do Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.
Materials
| 0.17 mm coverslip | No special requirements | ||
| 1.6 x 1.6 mm metal mesh | Buzifu | Fiberglass screen mesh | |
| 10 cm diameter pots | No special requirements | ||
| 140 mm Petri dishes | No special requirements | ||
| 20 mL syringe | No special requirements | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Agarose | Merk | ||
| Ampicillin sodium | GoldBio | ||
| Bacteriological agar | Roko | ||
| Confocal Microscope Stellaris | Leica Microsystems | ||
| FACSVerse cell analyzer | BD Biosciences | ||
| Fiji software | |||
| Gentamycin sulfate | Duchefa | G-0124 | |
| Kanamycin monosulfate | Phytotechnology | K378 | |
| MgCl2 | Merk | ||
| NaCl | Merk | ||
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | ||
| Plant substrate | No special requirements | ||
| Silwet L-77 | Cromton Europe Ltd | ||
| Toothpicks | No special requirements | ||
| Tryptone | Merk | ||
| Tweezers | No special requirements | ||
| Vacuum chamber 25 cm diameter | Kartell | 554 | |
| Vacuum pump | GAST | DOA-P504-BN | |
| Vermiculite | No special requirements | ||
| Yeast Extract | Merk |
Riferimenti
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