Summary
Descrevemos um protocolo para produção, cultura e visualização de cânceres humanos com metástase para as superfícies peritoneais. Os espécimes tumorais ressecados são cortados com vibratótomo e cultivados em insertos permeáveis para aumento da oxigenação e viabilidade, seguidos de análises de imagem e a jusante usando microscopia confocal e citometria de fluxo.
Abstract
O pseudomixoma peritoneal (PMP) é uma condição rara que resulta da disseminação de um tumor primário mucinoso e do consequente acúmulo de células tumorais secretoras de mucina na cavidade peritoneal. A PMF pode surgir de vários tipos de cânceres, incluindo apendicular, ovariano e colorretal, embora as neoplasias do apêndice sejam de longe a etiologia mais comum. O PMP é desafiador de estudar devido à sua (1) raridade, (2) modelos murinos limitados e (3) histologia mucinosa e acelular. O método aqui apresentado permite a visualização e interrogação em tempo real desses tipos tumorais utilizando cortes organotípicos ex vivo derivados do paciente em uma preparação onde o microambiente tumoral (TME) permanece intacto. Neste protocolo, primeiramente descrevemos o preparo de fatias tumorais utilizando um vibratomo e posterior cultura a longo prazo. Em segundo lugar, descrevemos imagens confocais de cortes tumorais e como monitorar leituras funcionais de viabilidade, imagens de cálcio e proliferação local. Em suma, as fatias são carregadas com corantes de imagem e são colocadas em uma câmara de imagem que pode ser montada em um microscópio confocal. Vídeos com lapso de tempo e imagens confocais são usados para avaliar a viabilidade inicial e a funcionalidade celular. Este procedimento também explora o movimento celular translacional e as interações de sinalização parácrina na EMT. Por fim, descrevemos um protocolo de dissociação de cortes tumorais a serem utilizados para análise por citometria de fluxo. A análise quantitativa por citometria de fluxo pode ser usada para testes terapêuticos de bancada para leito para determinar as mudanças que ocorrem na paisagem imune e no conteúdo das células epiteliais.
Introduction
O pseudomixoma peritoneal (PMP) é uma síndrome rara, com incidência de 1 por milhão de pessoas porano1. A maioria dos casos de PMF é causada por metástases de neoplasias do apêndice. Dado que os ratos não têm um apêndice semelhante ao humano, modelar este tipo de cancro continua a ser extremamente desafiante. Embora a doença primária seja frequentemente curável por ressecção cirúrgica, as opções de tratamento para doença metastática são limitadas. Portanto, a justificativa para o desenvolvimento deste novo modelo de fatiamento organotípico é estudar a patobiologia da PMP. Até o momento, não existem modelos organoides apendiculares que possam ser perpetuamente cultivados; entretanto, um modelo recente mostrou-se útil para o teste farmacológico de agentes terapêuticos eimunoterapia2. Para tanto, adaptamos um sistema de cultura organotípica de fatias que tem sido utilizado em outros tipos de cânceres humanos, como cérebro, mama, pâncreas, pulmão, ovário, entre outros3,4,5,6.
Além das neoplasias do apêndice, a PMF ocasionalmente resulta de outros tipos de tumores, incluindo cânceres ovarianos7 e, em raras circunstâncias, neoplasias mucinosas papilares intraductais8 e câncer de cólon9. Além disso, esses tumores tendem a crescer lentamente, com baixas taxas de enxerto em modelos de xenoenxerto derivado do paciente (PDX)10,11. Diante desses desafios, há uma necessidade não atendida de desenvolver modelos para estudar essa doença para começar a entender a fisiopatologia da PMP e como essas células cancerígenas são recrutadas para as superfícies peritoneais, proliferam e escapam da vigilância imunológica.
Embora cortados da circulação vascular sistêmica, os cortes tumorais contêm componentes celulares e acelulares, incluindo a matriz extracelular, células estromais, células imunes, células cancerosas, células endoteliais e nervos. Esse microambiente semi-intacto permite a investigação funcional desses tipos celulares, o que é excepcionalmente vantajoso em relação às culturas organoides 3D, que consistem apenas de célulascancerígenas12. Embora as culturas organotípicas de corte sejam vantajosas em alguns aspectos, elas também são inerentemente uma abordagem baseada em baixo rendimento, em comparação com organoides 3D, que podem ser expandidos e são adequados para triagem de drogas terapêuticas investigativas multiplexadas13,14,15. No caso da PMP, não há relatos documentando o estabelecimento confiável e a passagem perpétua de organoides derivados da PMP16. Isso provavelmente se deve à natureza de crescimento lento das células tumorais derivadas do PMP, bem como ao baixo número de células epiteliais malignas encontradas dentro desses tumores mucinosos. Dada a necessidade de desenvolver modelos para estudar PMF, fatias organotípicas são especialmente adequadas para estudar esta doença. Apresentamos um protocolo para preparação, aquisição de imagens e análise de PMP de espécimes humanos.
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Protocol
A desidentificação e aquisição de todos os tecidos foram realizadas sob um protocolo aprovado pelo IRB na Universidade da Califórnia, San Diego.
1. Preparação de tecidos humanos de PMP para processamento e cultura de tecidos
- Transporte de tecidos tumorais e microdissecção
- Preparar os meios de transporte e cultura: completar 10% (v/v) Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM), 10% FBS, 2 mM L-Glutamina, 1% Penicilina/Streptomicina (Pen Strep).
- Após a chegada do tecido e de acordo com um protocolo institucional aprovado pelo IRB, transfira tecidos tumorais PMP para 35 placas com um diâmetro de 6 cm contendo DMEM completo.
- Microdissecar regiões sólidas do tumor de qualquer mucina liquefeito com bisturi. Enquanto nódulos de mucina embutidos em porções sólidas do tecido podem ser cortados, remova todas as regiões liquefeitas do tumor. Além de remover qualquer mucina liquificada, ou regiões de tecido altamente mucinoso, remova qualquer tecido que seja difícil de cortar com um bisturi. Corte os nódulos de tecido em pedaços menores, com aproximadamente 1 cm3 de tamanho.
NOTA: A obtenção de nódulos tumorais limpos de mucina e MEC densa será essencial para o sucesso do corte com o uso de vibratome. Como controle de qualidade, o tecido tumoral que chega ao laboratório de pesquisa é primeiramente cortado por um patologista, que posteriormente é distribuído pelo biorrepositório da UCSD. Doadores de tecidos submetidos à remoção paliativa do bolo omental são casos ideais para esse protocolo, dada a alta carga de doença, o que possibilita maior produção de fatias a partir do aumento da massa de tecido disponível para pesquisa.
CUIDADO: Trabalhar com tecidos humanos requer certificação de Nível de Biossegurança 2 (BSL2). Verifique com a instituição para treinamento sobre os procedimentos BSL2.
- Preparação de agarose e incorporação de tecidos
- Preparar uma solução a 5% de agarose de baixo derretimento em PBS sem FBS no mesmo dia da chegada do tecido. Preste muita atenção à solução de agarose, pois ela tende a ferver rapidamente.
NOTA: A agarose de baixo derretimento é essencial para incorporar peças de tecido. A agarose de alto derretimento se solidificará em temperaturas mais altas, reduzindo a viabilidade de fatias de tecido se incorporadas. Além disso, o FBS na solução de dissolução causará a formação de precipitados. - Coloque os pedaços de tecido obtidos em placas de 6 cm sem líquido. Coloque não mais do que 2-3 peças por prato de 6 cm para que possam ser removidas como cubos de agarose sem perturbar ou tocar em outros tecidos.
- Adicione a solução líquida de agarose a 5% em pratos de 6 cm contendo os espécimes tumorais de 1 cm3 . Adicione agarose suficiente para cobrir apenas o espécime. Uma vez adicionados, coloque os lenços embutidos em um refrigerador a 4 °C por 30 min.
- Preparar uma solução a 5% de agarose de baixo derretimento em PBS sem FBS no mesmo dia da chegada do tecido. Preste muita atenção à solução de agarose, pois ela tende a ferver rapidamente.
- Montagem de espécimes de tecido no vibratomo
- Retire o ágar solidificado da geladeira e corte os cubos de agarose ligeiramente maiores que a largura do tecido usando um bisturi.
- Aplique super cola no estágio de vibratótomo e delicadamente coloque o cubo de agarose sobre a super cola. Deixe 1-2 min para a cola solidificar. Neste ponto, o cubo de agarose com tecido deve ser fixado ao estágio.
- Fixe a lâmina no vibratomo e ajuste a espessura desejada da seção de tecido. Para obter imagens a jusante ideais usando microscopia confocal, as seções devem ter aproximadamente 150 a 250 mícrons. Pressione o botão Iniciar e continue a percorrer o corte do bloco de tecido de agarose até que o tecido seja completamente cortado.
NOTA: Se o tecido não estiver cortando, ou se deslocar do cubo de agarose, considere incorporar o tecido em uma concentração maior de agarose e apague quaisquer pedaços de tecido adicionais que possam ser muito densos para cortar ou grudar na lâmina do vibratom.
- Corte de tecido de cultura em insertos permeáveis
- Preparar uma placa de inserção permeável para cultura adicionando 2 mL de meio DMEM completo acima e 3 mL abaixo da membrana permeável.
- Levante suavemente as fatias de tecido para fora da câmara de corte do vibratomo usando um pincel fino e coloque duas a quatro fatias em pratos de cultura permeáveis contendo meios DMEM completos. Após 24 h, aspirar o meio com pipeta e substituí-lo por meio de cultura fresco.
- Cultivar as fatias por até 7 dias a 37 °C/5% CO2, substituindo o meio a cada 24 h. Neste momento, adicionar controles para morte celular (bortezomib) e quimioterapias testáveis 5-fluoruracil (5-FU) aos meios de cultura para realizar a intervenção farmacológica.
- Após 7 dias de cultivo, espere uma perda de viabilidade de cerca de 15%-25% em comparação com o ponto de tempo do dia 0 (imediatamente após o corte) em condições não tratadas com medicamentos (DMEM completo). Medir a viabilidade usando corantes de viabilidade vivo-mortos, como calceína AM (vivo) e iodeto de propídio (morto).
2. Imagem confocal de fatias de tecido humano vivo
NOTA: Uma vez preparados os cortes organotípicos de tumor, é essencial determinar a viabilidade tecidual para realizar uma análise eficiente e otimizada a jusante. Dado que os espécimes tumorais têm 150-250 μm de espessura, a microscopia confocal ou de dois fótons é altamente recomendada em microscópios de campo largo para determinar estudos in situ. A citometria de fluxo também pode ser usada para determinar a viabilidade e as populações celulares (os métodos estão abaixo). No entanto, a resolução espacial é perdida durante a análise por citometria de fluxo, e a viabilidade é provavelmente subestimada, dada a necessidade de dissociar os cortes tumorais por métodos mecânicos e químicos.
- Preparação de reagentes e montagem experimental
- Coloque fatias tumorais para análise de imagens confocais em um único poço de uma placa de 12 poços contendo PBS com FBS a 1%. Para experimentos de imagem de cálcio, em vez de PBS, incubar as fatias em solução de cálcio extracelular preparada da seguinte forma: NaCl 125 mM, KCl 5,9 mM, CaCl2 2,56 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 25 mM, BSA 0,1%, pH 7,4, glicose 3 mM, filtrada estéril. Preparar esta solução com antecedência e armazená-la até 1 mês a 4 °C (ver secção 2.1.8).
- Seguindo as concentrações e protocolos recomendados pelo fabricante, corar amostras com corantes de imagem (ver Tabela de Materiais) para determinar a viabilidade de cortes de tecido. Imagem por 10 min-1 h após a adição do corante de viabilidade.
- Após a incubação, transfira as fatias para uma placa de Petri com fundo de vidro opticamente transparente contendo PBS com FBS a 1% para ser usada para aquisição de imagens em um dispositivo de imagem confocal.
OBS: Para exames de imagem confocais, foi utilizada a plataforma Nikon A1R Confocal. - Abra o software de imagem confocal. Comece a criar imagens em 10x e selecione o modo de geração de imagens XYZ. Em seguida, defina as configurações de aquisição da seguinte maneira.
- Ligue os seguintes lasers: 488 nm e 561 nm. Ajuste o ganho para 100 com potência do laser a 1%. Ajuste a potência do laser e ganhe conforme necessário durante a aquisição da imagem. Dependendo da qualidade de imagem desejada, selecione 512 x 512 pixels ou 1024 x 1024 pixels para maior resolução.
- Selecione Remover intertravamento e, em seguida, selecione Fazer varredura para iniciar a geração de imagens.
- Para imagens de cálcio, incubar fatias de tecido com Fluo-4-AM por 1 h protegido da luz. Siga o protocolo do fabricante para dissolver o Fluo-4-AM em DMSO. Após 1 h, lavar fatias 3x com solução de cálcio extracelular e seguir o protocolo de imagem nas etapas 2.1.4-2.1.5.
- Para experimentos de imagem de cálcio usando Fluo-4-AM, selecione XYZT e desmarque o laser de 561 nm para aumentar a velocidade de aquisição. Além disso, use o scanner de ressonância para aumentar ainda mais a velocidade da geração de imagens.
3. Dissociação de fatias vivas para citometria de fluxo
NOTA: A dissociação de fatias de tecido vivo pode ser usada para várias aplicações a jusante, incluindo imunotipagem, avaliação da viabilidade e interrogação das mudanças nas populações celulares após intervenção farmacológica. Devem ser tomadas medidas para garantir que a qualidade do tecido e a viabilidade celular sejam mantidas durante o processo de dissociação.
- Cortar um pequeno pedaço da extremidade de uma ponta de pipeta de 1 mL para ampliar a abertura para permitir uma dissociação mecânica vigorosa por pipetagem por 1 min.
- Incubar fatias a 37 °C com rotação por 5-15 min em 1 mL de tampão de digestão composto por DMEM com alto teor de glicose, 10% de colagenase/hialuronidase suave (GCH), 10% de SFB e 10% de DNaseI (estoque de 1 mg/mL).
NOTA: Alterações dependentes de lote de colagenase/hialuronidase são frequentemente encontradas. - Realizar ruptura vigorosa do tecido usando dissociação mecânica 2-3 vezes durante a incubação. Certifique-se de verificar a digestão, por olho, a cada 5 minutos para evidências de digestão completa. Se necessário, interromper a digestão enzimática prosseguindo para o passo 3.1.4.
- Uma vez digeridos, pipetar as fatias e o meio de digestão em cima de um filtro de 70 μm colocado sobre um tubo cônico de 50 mL. Escolha peças maiores usando pinças estéreis ou uma pipeta.
- Usando a extremidade traseira romba de uma seringa plástica de 5 mL, amasse quaisquer fatias maiores não dissociadas e lave com 4 mL de PBS contendo FBS a 2%.
- Tomar o sobrenadante celular dissociado em um tubo cônico de 50 mL e girar a 300 x g por 5-10 min. Retire o sobrenadante e lave o pellet com 1 mL de PBS contendo FBS a 2%.
- Para preparar a amostra para citometria de fluxo, adicionar o tampão de bloqueio contendo 50 μL de bloqueio Fc humano e deixar à temperatura ambiente por 15 min. Realizar coloração extracelular utilizando os respectivos anticorpos em 50 μL de PBS contendo SFB a 2%.
NOTA: Existem muitos sistemas de citometria de fluxo. Uma vez preparada a amostra para citometria de fluxo, consulte o protocolo do fabricante para operação do dispositivo.
4. Intervenção farmacológica utilizando cortes de tecidos vivos para análise de viabilidade e proliferação
NOTA: Uma vez que os cortes de tumor organotípicos tenham sido preparados, as abordagens intervencionistas podem ser realizadas usando vários métodos, incluindo testes de drogas, siRNA, bem como infecção viral de fatias de tecido vivo. Aqui discutiremos testes de drogas, bem como leituras funcionais a jusante, que incluem análise de viabilidade usando proliferação local.
- Preparar 10 mL de DMEM completo 10% v/v com FBS 10%, 2 mM L-Glutamina, 1% Pen Strep.
- Alíquota 5 mL de meio completo para condições de controle e tratamento. Aos 5 mL restantes de meio, adicionar bortezomib (2 μM) para induzir morte celular em cortes tumorais como controle positivo.
NOTA: O bortezomib, em altas concentrações, é uma droga citotóxica que induz a morte celular. As demais drogas citotóxicas podem ser utilizadas como controle positivo para morte celular. - Usando duas a quatro fatias de tecido, que foram plaqueadas nas placas permeáveis, adicione o meio preparado na etapa 4.2 ao prato, bem como quaisquer terapias combinadas adicionais a serem usadas para análise de viabilidade LIVE/DEAD a jusante usando microscopia confocal, conforme descrito na etapa 2.1.2, ou use uma análise de viabilidade luminescente comercial usando fatias sequencialmente combinadas.
NOTA: A correspondência de fatias sequenciais é essencial para a análise de viabilidade luminescente, uma vez que o ensaio de viabilidade luminescente depende do conteúdo de ATP celular. Como os controles internos são perdidos durante a lise celular, fatias de tamanho semelhante são necessárias, pois os resultados dependem do número inicial de células viáveis (ou seja, fatias desbalanceadas resultarão em resultados desbalanceados). Se o usuário não obtiver cortes sequenciais, a análise de viabilidade luminescente não é possível e, como tal, outro método de avaliação de viabilidade será necessário (citometria de fluxo ou análise de células vivas baseada em imagens confocais). - Deixar fatias de tecido em cultura contendo DMEM completo por 2-5 dias, trocando de meio, bem como bortezomib e 5-FU a cada dois dias.
- Para análise de viabilidade luminescente, adicione 500 μL de PBS em uma placa de 12 poços e transfira as fatias de tecido sequencialmente combinadas para a solução de PBS usando um pincel ou use a sucção de uma pipeta de 1 mL suavemente para transferi-las.
- Remova o PBS e adicione a solução de análise de viabilidade luminescente que foi preparada. Consulte o manual de instruções para preparação do reagente.
- Adicionar 500 μL da solução de viabilidade luminescente por condição e incubar com uma rotação lenta no agitador à temperatura ambiente durante 30 minutos. Leia a luminescência usando um leitor de placas de luminescência.
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Representative Results
Em suma, espécimes tumorais humanos de PMP são obtidos sob um protocolo aprovado pelo IRB. O tecido é preparado, microdissecado e solidificado em molde de agarose para ser cortado com vibratomo (Figura 1A; Vídeo 1). Uma vez cortados, os cortes de tecido são colocados e cultivados em membranas de inserção permeável (Figura 1B), que podem ser utilizadas para exames de imagem in situ, bem como para interrogação celular e funcional usando citometria de fluxo, análise confocal de imagem e ensaios de citotoxicidade. Um fluxo de trabalho representativo da cultura e processamento de cortes de tecido de PMP humano é mostrado na Figura 1C. A análise inicial por imagem pode ser realizada por microscopia óptica (Figura 2A-B). A coloração de mucina em cortes de tecido foi visualizada pela coloração de ácido periódico de Schiff (PAS) (Figura 2C) e anticorpos específicos para mucina (Figura 2D). Para avaliar a viabilidade, cortes cortados de diferentes regiões são incubados em calceína AM e iodeto de propídio para determinar sua sanidade e viabilidade (Figura 2E-F). A maioria das células (cerca de 85%) é viável (calceína AM+; verde), enquanto algumas células estão mortas (iodeto de propídio; vermelho) quando visualizadas por microscopia confocal após o corte inicial. A matriz extracelular pode ser visualizada utilizando-se uma incidência de luz branca em posição angular de 180°. Tumores tratados com quimioterapia antes da cirurgia geralmente mostram mais sinal de IP. A proliferação de cortes de tecido pode ser rastreada usando EdU adicionado no meio de cultura de corte. Para a detecção, foi utilizado um kit comercial de ensaio de proliferação celular, e o ensaio foi realizado em cortes fixos após 72 h de cultura. Células em proliferação ativa em cultura podem ser medidas no canal FITC (verde). Os núcleos celulares (DAPI) se sobreporão às células que proliferaram (EdU+) durante o cultivo (Figura 2G). Esses resultados são quantificados para determinar o número de células em proliferação (núcleos DAPI+) dentro do corte tumoral (Figura 2H). Os resultados aqui apresentados indicam que as fatias cultivadas são viáveis e proliferativas durante o cultivo em fatias.
Para identificar a funcionalidade das células imunes, foram realizados exames de imagem com Ca2+ em fatias tumorais vivas (Figura 3; Vídeo 2). Usando esta abordagem, mecanismos de sinalização direta e parácrina podem ser identificados. Para marcar as células imunes locais, a citomarcação in situ foi realizada incubando-se os cortes com um anticorpo conjugado CD11b-PE juntamente com Fluo-4-AM (Figura 3A). Imagens em escala pseudocolorida mostrando níveis intracelulares de Ca 2+ permitem visualizar melhor os níveis diferenciais de Ca2+ intracelular (Figura 3B). A atividade espontânea foi rastreada e imagens de lapso de tempo são mostradas para antes (Figura 3C), durante (Figura 3D) e depois (Figura 3E) de uma resposta intracelular de Ca2+ dentro da caixa de círculo pontilhada branca; Figura 3A,B) Célula imune CD11b+. Os traços brutos de respostas de Ca2+ na célula imune CD11b (vermelho) juntamente com outras células responsivas (preto) e não responsivas (azul) são mostrados (Figura 3F). Quantificação da área sob a curva dos traços brutos mostrados da célula imune respondedora (CD11b+; figura 3F vermelha) em comparação com a quantificação da célula não respondente (azul; Figura 3F) foram quantificados (Figura 3G). Esses resultados indicam que o rastreamento funcional de células vivas pode ser realizado utilizando esta plataforma de corte de tecido vivo.
A análise a jusante por citometria de fluxo pode ser usada para imunotipar e investigar alterações nos perfis celulares em resposta a agentes terapêuticos. Os resultados podem ser devidos à sinalização direta ou indireta (parácrina). Resultados representativos da imunotipagem de uma amostra tumoral de paciente com PMF são mostrados na Figura 4A. O imunoperfil tumoral foi quantificado e o espécime doador 337 apresentou altos níveis de macrófagos M2 (Figura 4B). Esses resultados indicam que a utilização de fatias de tecido derivadas de PMP permite que os pesquisadores questionem a paisagem celular única do doador das amostras tumorais do paciente. Uma análise e interrogação mais aprofundadas do cenário molecular, celular e genômico são necessárias para traçar estratégias para uma abordagem terapêutica à beira do leito que possa ser benéfica para os resultados dos pacientes.
A farmacotipagem e a análise a jusante de cortes de tecido de tecidos humanos PMP são um método direto para medir a quimiorresistência e a sensibilidade a drogas (Figura 5). Os resultados mostram morte celular de fatias tumorais, confirmada pela análise de citotoxicidade, bem como imagens confocais TUNEL em resposta à droga citotóxica bortezomib (2 μM) e 5-fluorouracil (5-FU; 2 μM) (Figura 5A-C). Como as respostas à morte tumoral são altamente heterogêneas, é importante estratificar os dados com base no grau tumoral e na QIPHTO prévia, uma vez que a quimioterapia repetida tem se mostrado um método ineficaz para abater células tumorais in vivo e ex vivo17,18. Além da análise TUNEL, a análise de viabilidade luminescente foi realizada usando cortes sequencialmente pareados (Figura 5D). É essencial usar cortes tumorais sequencialmente pareados ao realizar ensaios de citotoxicidade, pois cortes não compatíveis levarão a resultados não confiáveis.
Figura 1: Ilustração esquemática da plataforma de cultura de corte organotípico de pseudomixoma peritonei ex vivo com cortes representativos de tecido. Um fluxo de trabalho representativo para preparar culturas de fatias organotípicas para imunotipagem e investigar propriedades funcionais de tumores de pseudomixoma de origem apendicular. (A) Imagem de nódulo tumoral vivo de neoplasia de pseudomixoma peritoneal (PMP). O nódulo tumoral é embutido em agarose, que é fixada a um vibratomo usando super cola. (B) A distribuição representativa dos cortes tumorais cortantes e o arranjo em uma placa de cultura trans-poço. (C) O esquema que representa o fluxo de trabalho de cultura de cortes e interrogação de fatias tumorais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagem confocal e análise funcional de cortes de tecidos vivos . (A) Imagem de campo claro Aumento de 2x de corte representativo de tecido de paciente com pseudomixoma peritoneal de origem apendicular. (B) Aumento de 10x do corte representativo de tecido mostrado em A. (C) Coloração PAS de um tecido de um paciente com pseudomixoma peritoneal. Barra de escala 1 mm. (D) Imagem de imunofluorescência usando anticorpo MUC2 (verde), EPCAM (vermelho) e DAPI (azul). Barra de escala 50 μm. (E) Imagem por imunofluorescência utilizando corantes vivos (calceína AM; verde) e mortos (iodeto de propídio; vermelho) do doador 39. Barra de escala 50 μm. (F) Quantificação da análise de viabilidade utilizando três cortes separados do doador 39 durante o corte inicial do tecido. As barras de erro são o erro padrão da média. (G) Imagem de proliferação por imunofluorescência usando EdU (verde). Os núcleos celulares são marcados com DAPI (azul). (H) Quantificação do número de células EdU positivas por 1.000 células. N = 3 fatias representativas do doador 39. As barras de erro são o erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Rastreamento de células vivas usando imagens de cálcio de cortes de tecido vivo. (A) Citomarcação in situ de um corte de tecido vivo do doador 292. Macrófagos marcados com CD11b mostrados em vermelho. Corante de imagem de cálcio Fluo-4-AM (verde). Macrófago co-marcado com CD11b e Fluo-4-AM destacado na cor branca. (B) Escala de pseudocor de um corte de tecido vivo (mostrado em A). Macrófago destacado em branco como em A. Barra de escala mostrando 100 μm aplica-se a A. Barra de escala de pseudocor mostrada como valores médios de cinza. (C-E) Imagem de alta magnificação do Fluo-4-AM antes (C), durante (D) e após (E) ativação do cálcio. (F) Quantificação dos níveis de cálcio demonstrados por vestígios brutos. O macrófago CD11b+ destacado em A-E é destacado em vermelho. Uma célula que não responde é realçada em azul. Os outros traços de células que respondem são mostrados em preto. (G) Quantificação da área normalizada sob a curva mostrada entre o macrófago CD11b+ e uma célula não respondedora. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imunotipagem de cortes tumorais humanos vivos de pseudomixoma peritoneal. (A) Esquema representativo para a realização de citometria de fluxo para caracterização de perfis de células imunes de tumores de pseudomixoma de origem apendicular. (B) A porcentagem de subgrupos de células imunes são codificados por cores, bem como a barra média do doador plotada. Os marcadores de cor acima são fornecidos para subconjuntos de células imunes dentro de gráficos de pizza. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Análise representativa para intervenção farmacológica utilizando cultura organotípica de cortes. (A) Imunofluorescência de imagens representativas da análise TUNEL em cortes tratados com 5-FU (2 μM; coluna do meio) ou Bortezomib (2 μM; coluna direita). (B) Quantificação da imunofluorescência de TUNEL como porcentagem de células DAPI+ positivas para TUNEL do doador 339. (C) Quantificação da imunofluorescência de TUNEL como porcentagem de células PanCK+ positivas para TUNEL do doador 339. (D) Quantificação de fatias tratadas com drogas usando análise de viabilidade luminescente do doador 339 agrupadas a partir de 2-3 réplicas biológicas sequencialmente pareadas. CTL denota controle. Concentração para controle, 5-FU (2 μM) e Bortezomib (2 μM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: Corte de fatias de tecido humano vivo de nódulos tumorais mucinosos metastáticos. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 2: Imagem de cálcio de cortes de tumor organotípico vivo de pseudomixoma peritoneal. Imagens pseudocoloridas de projeção máxima a partir de imagens confocais de um corte de tecido vivo carregado com Fluo-4-AM no ponto de tempo 00:00. A barra de escala é de 50 μm (canto inferior direito). Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
Este manuscrito descreve uma técnica que pode ser usada para cultura, interrogação e análise de espécimes tumorais de pseudomixoma peritoneal humano (PMP). Utilizamos numerosos ensaios funcionais a jusante para interrogar o microambiente imune do tumor e uma plataforma para testes de bancada para leito.
Embora o método seja altamente eficiente em nossas mãos, será necessária alguma prática para cortar espécimes tumorais usando um vibratome. Ou seja, encontramos problemas que foram devidos a amostras altamente mucinosas, bem como amostras que foram inadequadamente microdissecadas para remover arcabouços não cutíveis (parede abdominal, ascite, várias proteínas da MEC). Como tal, a microdissecção do tecido PMF para remover o excesso de mucina é uma etapa crítica deste protocolo. Relatamos uma taxa de sucesso de 80% em pacientes com nódulos sólidos, como relatado anteriormente. Amostras de alto grau foram tecnicamente menos desafiadoras para cortar18. Além disso, a preparação de agarose (sem FBS) e a solidificação do tecido em agarose também são importantes para este protocolo, a fim de produzir cortes de tecido. Além disso, será essencial que o pesquisador esteja ciente das informações sobre as condições teciduais e parâmetros cirúrgicos do espécime (localização da metástase, amostras pré-tratadas), pois isso ajudará a novos insights, bem como ajudará a resolver possíveis problemas de solução de problemas. Outro passo crítico neste protocolo é na análise funcional das células tumorais. Aqui, é essencial usar um marcador epitelial (como a coloração de citoqueratina) em combinação com uma leitura funcional (apoptose, proliferação) para avaliar a eficácia. Isso é necessário neste tipo particular de tumor, pois muitos tumores PMP têm menos de 10% da composição celular como célulastumorais18. Como tal, a citometria de fluxo ou imagem confocal é o método preferido de análise. No entanto, ensaios de alto rendimento usando imagens baseadas em luminescência podem ser apropriados em tumores com maior conteúdo de células tumorais ou se avaliarem o papel da terapêutica na EMT.
Apesar de ser uma ferramenta poderosa, a cultura organotípica de fatias tem certas limitações. Por exemplo, um desafio dessa técnica é a heterogeneidade celular dentro dos tumores. Para explicar a heterogeneidade tumoral, cortes sequencialmente cortados de regiões tumorais semelhantes devem ser pareados entre os grupos para tratamento e análise da viabilidade celular. O corte e o preparo de fatias requerem prática para microdissecar arcabouços tumorais não cutáveis. Essas habilidades são necessárias para o sucesso do corte e otimização de fatias de tecido para limitar vieses experimentais. Outra limitação é a viabilidade tecidual durante o corte de cultura. Embora seja possível manter cortes cerebrais ou cardíacos por meses em culturas 19,20, atualmente as culturas de cortes de PMP só foram testadas por cerca de 1 semana em cultura 18, o que impede a investigação experimental em longo prazo, incluindo tratamento medicamentoso crônico e manipulação genética. Melhorias nos métodos de cultura, como a adição de suplementos e fatores de crescimento, podem ser necessárias para prolongar a vida útil das culturas de fatias de PMP.
A cultura organotípica de fatias é uma técnica amplamente utilizada para estudar vários órgãos, incluindo cérebro, rim e fígado. Adotamos esta técnica para uso durante o PMP, fornecendo-nos um sistema modelo alternativo que, até onde sabemos, é o primeiro modelo a examinar o microambiente tumoral do PMF em uma preparação semi-intacta. Em conjunto com organoides 3D derivados do paciente e culturas de explantes, esta técnica oferece uma plataforma robusta e flexível para avaliar rapidamente a eficácia do tratamento e permitir a tradução imediata de novas terapias da bancada para a beira do leito.
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Disclosures
Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Kersi Pestonjamasp da instalação do núcleo de imagem do Moores Cancer Center pela ajuda com os microscópios UCSD Specialized Cancer Support Center P30 grant 2P30CA023100. Este trabalho foi adicionalmente apoiado por uma bolsa de publicação JoVE (JRW), bem como generosos presentes do espólio de Elisabeth e Ad Creemers, da Euske Family Foundation, do Gastrointestinal Cancer Research Fund e do Peritoneal Metastasis Research Fund (AML).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| 100 micron filter | ThermoFisher | 22-363-549 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| ATPγS | Tocris | 4080 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | L3224 | |
| CD11b | Biolegend | 101228 | |
| CD206 | Biolegend | 321140 | |
| CD3 | Biolegend | 555333 | |
| CD4 | Biolegend | 357410 | |
| CD45 | Biolegend | 304006 | |
| CD8 | Biolegend | 344721 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G9681 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965084 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Fc-block | BD Biosciences | 564220 | |
| Fluo-4 | Thermo Fisher | F14201 | |
| Gentle Collagenase/Hyaluronidase | Stem Cell | 7912 | |
| Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Imaging Chamber Platform | Warner Instruments | PH-1 | |
| LD-Blue | Biolegend | L23105 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| LIVE/DEAD imaging dyes | Thermofisher | R37601 | |
| Nikon Ti microscope | Nikon | Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096x4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives. | |
| Peristaltic pump | Isamtec | ISM832C | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | L3224 | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA |
References
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