Ортотопическая имплантация раковых клеток, полученных от пациентов, у мышей повторяет прогрессирующий колоректальный рак
Summary
Этот протокол описывает ортотопическую имплантацию раковых клеток пациента в стенку слепой кишки мышей с иммунодефицитом. Модель повторяет прогрессирующее метастатическое заболевание колоректального рака и позволяет оценивать новые терапевтические препараты в клинически значимом сценарии метастазов в легких и печени.
Abstract
За последнее десятилетие были созданы более сложные доклинические модели колоректального рака (КРР) с использованием раковых клеток, полученных от пациентов, и 3D-опухолей. Поскольку органоиды опухоли, полученные от пациента, могут сохранять характеристики исходной опухоли, эти надежные доклинические модели позволяют проводить скрининг лекарств от рака и изучать механизмы лекарственной устойчивости. Тем не менее, смерть, связанная с КРР, у пациентов в основном связана с наличием метастатического заболевания. Поэтому важно оценить эффективность противораковой терапии в соответствующих моделях in vivo , которые действительно повторяют ключевые молекулярные особенности метастазирования рака у человека. Мы создали ортотопическую модель, основанную на инъекции раковых клеток, полученных от пациентов с КРР, непосредственно в стенку слепой кишки мышей. Эти опухолевые клетки развивают первичные опухоли в слепой кишке, которые метастазируют в печень и легкие, что часто наблюдается у пациентов с прогрессирующим КРР. Эта мышиная модель КРР может быть использована для оценки реакции на лекарственные препараты, контролируемые с помощью микрокомпьютерной томографии (мкКТ), клинически значимого метода мелкомасштабной визуализации, который может легко идентифицировать первичные опухоли или метастазы у пациентов. В этой статье мы опишем хирургическую процедуру и необходимую методологию для имплантации раковых клеток, полученных от пациентов, в стенку слепой кишки мышей с иммунодефицитом.
Introduction
Колоректальный рак (КРР) является второй по значимости причиной смерти отрака во всем мире1. Способность генерировать модели опухолей in vitro или in vivo, полученные из отдельных опухолевых клеток пациента, позволила продвинуть прецизионную медицину в онкологии. За последнее десятилетие органоиды, полученные от пациентов (PDO) или ксенотрансплантаты (PDX), использовались многими исследовательскими группами по всему миру2. ЗОП представляют собой многоклеточные структуры in vitro, которые напоминают особенности исходной опухолевой ткани и могут самоорганизовываться и самообновляться3. Эти многообещающие модели in vitro могут быть успешно использованы для скрининга лекарственных препаратов и содействия трансляционным исследованиям. С другой стороны, модели PDX точно повторяют исходный CRC на всех соответствующих уровнях, от гистологии до молекулярных признаков и реакции на лекарственное средство 2,4.
In vivo Модели PDX в основном выращиваются в виде подкожных опухолей у мышей с иммунодефицитом. Используя этот подход, PDX стали золотым стандартом в исследованиях рака, особенно для изучения чувствительности или резистентности к лекарственным препаратам. Тем не менее, смертельные случаи, связанные с КРР, в основном связаны с наличием метастатических поражений в печени, легких или брюшной полости, и ни один из двух подходов (PDO или PDX) не может повторить продвинутую клиническую ситуацию. Кроме того, было показано, что конкретный очаг роста опухоли определяет важные биологические характеристики, влияющие на эффективность препарата и прогноз заболевания2. В связи с этим существует острая необходимость в создании доклинических моделей, которые могут быть использованы для оценки эффективности противоопухолевых препаратов в клинически значимых метастатических условиях6.
Сканеры микрокомпьютерной томографии (мкКТ) могут функционировать как уменьшенные клинические компьютерные томографы, обеспечивая первичную визуализацию опухолей и метастазов у мышей с масштабированным разрешением изображения, пропорциональным разрешению КТ онкологических больных7. Для противодействия плохому контрастированию мягких тканей при методе μКТ можно использовать рентгенологические йодсодержащие контрастные вещества для улучшения контраста и оценки опухолевой нагрузки. Используя метод двойного контрастирования, йод вводится перорально и внутрибрюшинно в разное время. Контрастное вещество, вводимое перорально, помогает определить границы между опухолевой тканью и содержимым слепой кишки внутри кишечника. С другой стороны, контрастное вещество, вводимое внутрибрюшинно, позволяет определить внешние границы опухолевой массы, которая часто растет и прорастает в брюшину8.
В статье описан протокол выполнения ортотопической имплантации раковых клеток пациента в стенку слепой кишки мышей с иммунодефицитом, а также методика мониторинга роста опухоли кишечника с помощью μКТ-сканирования. В настоящей статье показано, что модель повторяет клинический сценарий распространенных опухолей кишечника и метастатических заболеваний у пациентов с КРР, которые не могут быть изучены с помощью моделей PDO или PDXO. Поскольку ортотопические PDX-модели КРР повторяют клинический сценарий пациентов с КРР, мы пришли к выводу, что они являются лучшими на сегодняшний день для тестирования эффективности противоопухолевых препаратов при распространенных опухолях кишечника и метастатических заболеваниях.
Protocol
Representative Results
Discussion
За последние несколько десятилетий было разработано и опробовано множество новых противоопухолевых методов лечения у пациентов с различными типами опухолей, включая колоректальный рак (КРР). Несмотря на то, что во многих случаях наблюдались многообещающие результаты на доклинически?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Выражаем признательность за поддержку Фонду Cellex, сети CIBERONC и Instituto de Salud Carlos III. Кроме того, мы также благодарим платформу доклинической визуализации в Научно-исследовательском институте Валь д’Эброн (VHIR), где проводились эксперименты.
Materials
| REAGENT | |||
| Apo-Transferrin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | T1147-500MG | |
| B27 Supplement | Life Technologies S.A (Spain) | 17504044 | |
| Chlorhexidine Aqueous Solution 2% | DH MATERIAL MÉDICO, S.L. | 1111696250 | |
| Collagenase | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | C0130-500MG | |
| D-(+)-Glucose | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | G6152 | |
| DMEM /F12 | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 21331-020 | |
| DNase I | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | D4263-5VL | |
| EGF | PEPRO TECH EC LTD. | AF-100-15-500 µg | |
| FGF basic | PEPRO TECH EC LTD. | 100-18B | |
| Fungizone | Life Technologies S.A (Spain) | 15290026 | |
| Gentamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15750037 | |
| Heparin Sodium Salt | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | H4784-250MG | |
| Insulin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | I9278-5ML | |
| Iopamiro | |||
| Isoflurane | – | – | |
| Kanamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15160047 | |
| L-Glutamine | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 25030032 | |
| Matrigel Matrix | CULTEK, S.L.U. | 356235/356234/354234 | |
| Metacam, 5 mg/mL | – | – | |
| Non-essential amino acids | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11140035 | |
| Nystatin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | N4014-50MG | |
| Pen/Strep | Life Technologies S.A (Spain) | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | Labclinics S.A | L0615-500 | |
| Progesterone | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P0130-25G | |
| Putrescine | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P5780-5G | |
| RBC Lysis Buffer | Labclinics S.A | 00-4333-57 | |
| Sodium Pyruvate | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11360039 | |
| Sodium Selenite | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | S5261-25G | |
| ESSENTIAL SUPPLIES | |||
| 8 weeks-old NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mice | – | – | |
| BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 needle 0.33 mm (29G) x 12.7 mm | BECTON DICKINSON, S.A.U. | 320926 | |
| Blade #24 | – | – | |
| Cell Strainer 100 µm | Cultek, SLU | 45352360 | |
| Forceps and Surgical scissors | – | – | |
| Heating pad | – | – | |
| Lacryvisc, 3 mg/g, ophthalmic gel | – | – | |
| Surfasafe | – | – | |
| Suture PROLENE 5-0 | JOHNSON&JOHNSON S, A. | 8720H | |
| EQUIPMENT/SOFTWARE | |||
| Quantum FX µCT Imaging system | Perkin Elmer | Perkin Elmer | http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083 |
Riferimenti
- Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clinical Cancer Research. 19 (24), 6787-6801 (2013).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews. Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
- Vatandoust, S., Price, T. J., Karapetis, C. S. Colorectal cancer: Metastases to a single organ. World Journal of Gastroenterology. 21 (41), 11767-11776 (2015).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. The American Journal of Pathology. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Durkee, B. Y., Weichert, J. P., Halberg, R. B. Small animal micro-CT colonography. Methods. 50 (1), 36-41 (2010).
- Boll, H., et al. Double-contrast micro-CT colonoscopy in live mice. International Journal of Colorectal Disease. 26 (6), 721-727 (2011).
- O’Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
- Jensen, M. M., Jorgensen, J. T., Binderup, T., Kjaer, A. Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper. BMC Medical Imaging. 8, 16 (2008).
- Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
- Chicote, I., Camara, J. A., Palmer, H. G. Advanced colorectal cancer orthotopic patient-derived xenograft models for cancer and stem cell research. Methods in Molecular Biology. 2171, 321-329 (2020).
