Rekonstitution der Zytoarchitektur und Funktion von humanem Epithelgewebe auf einem offenen Organchip

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Fähigkeiten und die wesentlichen Kulturmodalitäten des Open-Top Organ-Chips für die erfolgreiche Etablierung und Reifung von Organ-on-Chip-Kulturen in voller Dicke von primären Geweben (Haut, Alveole, Atemwege und Darm) und bietet die Möglichkeit, verschiedene funktionelle Aspekte der humanen epithelial/mesenchymalen und vaskulären Nischenschnittstelle in vitro zu untersuchen.

Abstract

Fast alle menschlichen Organe sind mit Epithelgewebe ausgekleidet, das aus einer oder mehreren Schichten eng verbundener Zellen besteht, die in dreidimensionalen (3D) Strukturen organisiert sind. Eine der Hauptfunktionen von Epithelien ist die Bildung von Barrieren, die das darunter liegende Gewebe vor physikalischen und chemischen Beleidigungen und Infektionserregern schützen. Darüber hinaus vermitteln Epithelien den Transport von Nährstoffen, Hormonen und anderen Signalmolekülen, wodurch oft biochemische Gradienten entstehen, die die Zellpositionierung und Kompartimentierung innerhalb des Organs steuern. Aufgrund ihrer zentralen Rolle bei der Bestimmung der Organstruktur und -funktion sind Epithelien wichtige therapeutische Angriffspunkte für viele menschliche Krankheiten, die nicht immer von Tiermodellen erfasst werden. Neben den offensichtlichen Unterschieden zwischen den Arten wird die Durchführung von Forschungsstudien über die Barrierefunktion und die Transporteigenschaften von Epithelien bei Tieren durch die Schwierigkeit des Zugangs zu diesen Geweben in einem lebenden System noch verstärkt. Während zweidimensionale (2D) menschliche Zellkulturen für die Beantwortung grundlegender wissenschaftlicher Fragen nützlich sind, liefern sie oft schlechte In-vivo-Vorhersagen . Um diese Einschränkungen zu überwinden, hat sich in den letzten zehn Jahren eine Vielzahl von mikrotechnisch hergestellten biomimetischen Plattformen, die als Organs-on-a-Chip bekannt sind, als vielversprechende Alternative zu herkömmlichen In-vitro – und Tierversuchen herausgestellt. Hier beschreiben wir einen Open-Top-Organ-Chip (oder Open-Top-Chip), eine Plattform zur Modellierung organspezifischer Epithelgewebe, einschließlich Haut, Lunge und Darm. Dieser Chip bietet neue Möglichkeiten für die Rekonstruktion der multizellulären Architektur und Funktion von Epithelgeweben, einschließlich der Fähigkeit, eine 3D-Stromakomponente durch den Einbau gewebespezifischer Fibroblasten und Endothelzellen in ein mechanisch aktives System nachzubilden. Dieser Open-Top-Chip bietet ein noch nie dagewesenes Werkzeug für die Untersuchung von epithelialen/mesenchymalen und vaskulären Interaktionen auf verschiedenen Auflösungsskalen, von einzelnen Zellen bis hin zu mehrschichtigen Gewebekonstrukten, und ermöglicht so die molekulare Zerlegung der interzellulären Wechselwirkung epithelialisierter Organe in Gesundheit und Krankheit.

Introduction

In der Vergangenheit haben sich Wissenschaftler bei der Arzneimittelforschung auf präklinische Tierversuche verlassen, aber eine wachsende Zahl dieser Methoden wurde aufgrund der schlechten Korrelation mit dem menschlichen Ergebnis in Frage gestellt¹. Die Umsetzung der “3R”-Prinzipien zum Ersetzen, Reduzieren und Verfeinern von Tierversuchen drängt Wissenschaftler, neue alternative In-vitro-Methoden zu finden, um die präklinische Risikobewertung von Arzneimitteln und chemischer Toxikologie^{zu unterstützen 2}. Vielen bisher entwickelten In-vitro-Modellen fehlt jedoch die biologische Architektur, die zelluläre Komplexität und die mechanische Umgebung, die erforderlich sind, um die dynamische Natur menschlicher lebender Organe zu rekapitulieren ^3,4.

Konventionelle präklinische In-vitro-Systeme verwenden in der Regel 2D-Monokulturen menschlicher Zellen, die auf einer starren Kunststoffoberfläche gezüchtet werden. Diese Methoden bieten ein Werkzeug für die Durchführung einfacher mechanistischer Studien und ermöglichen ein schnelles Screening von Wirkstoffkandidaten. Aufgrund ihrer relativ geringen Kosten und hohen Robustheit werden 2D-Modelle häufig mit automatischen Hochdurchsatzsystemen kombiniert und zur schnellen Identifizierung potenzieller Wirkstoffkandidaten in der frühen Phase des Arzneimittelentwicklungsprozesses verwendet ^5,6. Solche 2D-Modelle bieten jedoch keinen translationalen Ansatz zur Modellierung von Gewebe-, Organ- oder systemischen Reaktionen auf therapeutische Kandidaten, der für genaue Vorhersagen der Arzneimittelsicherheit und -wirksamkeit während der präklinischen Phase ihrer Entwicklung erforderlich ist. Flachzellkulturen rekapitulieren nicht die native Gewebemikroumgebung, einschließlich des komplexen multizellulären Zusammenspiels, der biomechanischen Eigenschaften und der dreidimensionalen (3D) Architektur menschlicher Gewebe⁷. Zellen, die auf einer flachen Oberfläche wachsen, erhalten oft keinen reifen Phänotyp und können daher nicht auf pharmakologische Reize reagieren, wie dies im nativen Gewebe der Fall wäre. Zum Beispiel weisen primäre menschliche Alveolarepithelzellen, die in vitro gezüchtet wurden, einen Plattenepitheltyp auf und verlieren wichtige phänotypische Marker, einschließlich der Tensidproteine C und B (SP-C und SP-B)⁸. Neben einer unzureichenden Differenzierung werden Primärzellen in vitro häufig unempfindlich gegenüber biologischen Stressoren, da bestimmte biochemische Signalwege, die mit Gewebeentzündungen assoziiert sind, funktionsunfähig werden⁹. Ein solcher Verlust der Zellfunktion scheint in erster Linie mit der Verwendung steifer Substrate sowie dem Mangel an löslichen Faktoren verbunden zu sein, die auf natürliche Weise von gewebespezifischen Stromazellen wie Lungenfibroblasten und glatten Muskelzellen freigesetzt werden^10,11.

Das Verständnis, dass der Mangel an chemophysikalischer und biologischer Komplexität das physiologische Verhalten von Zellen in vitro einschränkt, hat die Entwicklung ausgefeilterer multizellulärer Modelle gefördert, die nachweislich die Komplexität des menschlichen Gewebes außerhalb des Körpers besser erfassen^12,13. Seit der Entwicklung der ersten Co-Kulturmodelle in den frühen 1970er Jahren¹⁴ hat die Einführung synthetischer und natürlicher Hydrogele die Fähigkeit, native Gewebemikroumgebungen nachzuahmen, erheblich verbessert und ist zu einem unschätzbaren Werkzeug geworden, um die zelluläre Differenzierung voranzutreiben, die Selbstorganisation von Zellen in gewebeähnliche Strukturen zu lenken und native Gewebefunktionen wiederherzustellen^15,16. Wenn menschliche Zellen beispielsweise im entsprechenden 3D-Gerüst gezüchtet werden, können sie sich selbst zu funktionellen Strukturen wie Sphäroiden oder Organoiden anordnen, Stammzellmarker exprimieren und sich selbst erneuern¹⁷. Im Gegensatz dazu altern menschliche Zellen (einschließlich Stammzellen), wenn sie auf herkömmlichen 2D-Substraten gezüchtet werden, schnell und durchlaufen nach wenigen Passagen eine Seneszenz¹⁸. Darüber hinaus können Hydrogele auf bestimmte Gewebeeigenschaften wie Porosität, Porengröße, Faserdicke, Viskoelastizität, Topographie und Steifigkeit “zugeschnitten” oder mit aus Gewebe gewonnenen zellulären Komponenten und/oder bioaktiven Molekülen weiterentwickelt werden, um eine Nachahmung der physiologischen oder pathologischen Bedingungen zu ermöglichen^19,20. Trotz ihres enormen Potenzials für Arzneimitteltests rekapitulieren 3D-Hydrogel-basierte Modelle, die in der pharmazeutischen Forschung verwendet werden, die komplexe Zytoarchitektur des In-vivo-Gewebes nicht vollständig und es fehlen wichtige hämodynamische und mechanische Reize, die normalerweise im menschlichen Körper vorhanden sind, einschließlich hydrostatischem Druck, zyklischer Dehnung und Flüssigkeitsscherung²¹.

Mikrophysiologische Systeme (MPS) wie Organs-on-Chips (OOCs) haben sich in jüngster Zeit als Werkzeuge herausgestellt, die in der Lage sind, komplexe physiologische Reaktionen in vitro zu erfassen ^22,23. Diese Modelle verwenden häufig mikrofluidische Plattformen, die die Modellierung der dynamischen Mikroumgebung lebender Organe ermöglichen.

Wir haben die Prinzipien des 3D-Gewebe-Bioengineerings und der Mechanobiologie kombiniert, um ein Open-Top-Chip-Modell von komplexem menschlichem Epithelgewebe zu erstellen. Dies ermöglichte es uns, die multizelluläre und dynamische Mikroumgebung des Epithelgewebes genau zu rekapitulieren. Dazu gehören gewebespezifische biochemische und biomechanische Hinweise, die natürlicherweise in lebenden Organen vorhanden sind, aber von herkömmlichen In-vitro-Modellen oft vernachlässigt werden²⁴. Der Open-Top-Chip besteht aus zwei Kompartimenten: einem Gefäßkompartiment (Abbildung 1A) und einem Stromakompartiment (Abbildung 1B), die durch eine poröse Membran getrennt sind und die Diffusion von Nährstoffen zwischen den beiden Kammern ermöglichen (Abbildung 1C). Das Gefäßkompartiment ist einem kontinuierlichen Flüssigkeitsfluss ausgesetzt, um die physiologische Scherbelastung zu rekapitulieren, während das dehnbare Design der Stromakammer die Modellierung der mechanischen Belastung ermöglicht, die mit Atembewegungen oder Darmperistaltik verbunden ist. Das Stromakompartiment beherbergt das einstellbare 3D-Hydrogel-Gerüst, das das physiologische Wachstum gewebespezifischer Fibroblasten unterstützt. Es verfügt über einen abnehmbaren Deckel, der die Einrichtung einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche erleichtert, eine Bedingung, die eine bessere Nachahmung der menschlichen Physiologie von Schleimhautgeweben sowie einen direkten Zugang zum Gewebe für die Verabreichung von Medikamenten direkt auf die Epithelschicht ermöglicht. Ergänzende Abbildung 1 zeigt einige der Schlüsselkomponenten des Open-Top-Chip-Designs, einschließlich Abmessungen und biologischer Kompartimente (ergänzende Abbildung 1A-D) sowie die wichtigsten technischen Schritte, die in diesem Protokoll beschrieben sind (ergänzende Abbildung 1E).

Die Perfusion des Open-Top-Chips wird mit einer programmierbaren Peristaltikpumpe erreicht (Abbildung 1D). Der Aufbau der Peristaltikpumpe ermöglicht die gleichzeitige Perfundierung von 12 Open-Top-Chips. Die meisten Inkubatoren können zwei Setups beherbergen, so dass bis zu 24 Chips pro Inkubator kultiviert werden können. Die mechanische Streckung wird durch einen speziell angefertigten programmierbaren Vakuumdruckregler erreicht (Abbildung 1E). Es besteht aus einem elektropneumatischen Vakuumregler, der elektronisch von einem Digital-Analog-Wandler gesteuert wird. Mit anderen Worten, der elektropneumatische Vakuumregler erzeugt ein sinusförmiges Vakuumprofil mit einer vom Benutzer festgelegten Amplitude und Frequenz. Eine zyklische Dehnung von 0 % bis 15 % wird erzeugt, indem Unterdruck auf den Vakuumkanal des Open-Top-Chips mit einer Amplitude von 0 bis -90 kPa und einer Frequenz von 0,2 Hz ausgeübt wird. Es handelt sich um ein maßgeschneidertes System, das der kommerziell erhältlichen Flexcell-Dehnungseinheit entspricht, die zuvor verwendet und in anderen Veröffentlichungen²⁵ beschrieben wurde. Um die mechanische Gewebeverformung nachzuahmen, die beispielsweise mit der Atembewegung der Lunge oder der Peristaltik des Darms verbunden ist, wendet der pneumatische Aktuator sinusförmige Vakuum-/Dehnungswellen an, deren Größe und Amplitude an das physiologische Belastungsniveau und die Frequenz angepasst werden können, die menschliche Zellen in ihrem nativen Gewebe erfahren.

Hier beschreiben wir eine effiziente und reproduzierbare Methode zur Entwicklung und Kultivierung organotypischer Epitheläquivalente auf einer prototypischen Open-Top-Chip-Plattform. Es ermöglicht die Erzeugung komplexer Organmodelle wie Haut, Alveole, Atemwege und Dickdarm unter gleichzeitiger Integration eines Gefäßflüssigkeitsflusses und mechanischer Dehnung. Wir werden die wichtigsten technischen Aspekte skizzieren, die bei der Umsetzung der Prinzipien des Tissue Engineering zur Erzeugung komplexer Epithelmodelle berücksichtigt werden müssen. Wir werden die Vorteile und möglichen Einschränkungen des aktuellen Designs diskutieren.

Einen Überblick über die wichtigsten Schritte zur Gewebe- und Organreifung, einschließlich der Fluss- und Dehnungsparameter, finden Sie in: Abbildung 2 für die Haut, Abbildung 3 für die Alveole, Abbildung 4 für die Atemwege und Abbildung 5 für den Darm. Weitere Informationen zur Zusammensetzung der Medien und zu den Reagenzien, die für die Kultivierung der verschiedenen Organmodelle verwendet werden, sind in den Ergänzungstabellen enthalten (Ergänzungstabelle 1 für die Haut; Ergänzende Tabelle 2 für die Alveole; Ergänzungstabelle 3 für die Atemwege und Ergänzungstabelle 4 für den Darm).

Protocol

Humane Kolonoide wurden aus Darmresektionen gemäß den Richtlinien des Institutional Biosafety Committee des Cincinnati Children’s Hospital (IBC 2017-2011) gewonnen. 1. Aktivierung der Oberfläche Vorbereitung des AktivierungspuffersLegen Sie den Vernetzer und die Lösungsmittelpufferreagenzien unter die Biosicherheitswerkbank (BSC) und lassen Sie sie vor Gebrauch 10 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) äquilibrieren. Rekonstituieren Sie 5 mg Ver…

Representative Results

Mikrostrukturierung von OberflächenDie Mikrostrukturierung der extrazellulären Matrix (EZM) kann verwendet werden, um die räumliche Konfiguration der intestinalen Kryptenschnittstelle zu replizieren. Die Open-Top-Chip-Konfiguration kann modifiziert werden, um mikrostrukturierte Stempel zu integrieren, die speziell entwickelt wurden, um die natürliche Topographie der Dickdarmepithel-Stroma-Grenzfläche (Abbildung 6A, B) und der Darmkrypten im Mikromet…

Discussion

Der Open-Top-Chip stellt eine Plattform dar, um das komplexe zelluläre Zusammenspiel zwischen Endothel, Stroma und Epithel in einer kontrollierten Mikroumgebung in Echtzeit zu untersuchen. Diese Technologie bietet entscheidende Vorteile gegenüber herkömmlichen organotypischen und organoiden Kulturen, wie z. B. die Integration physikalischer und biochemischer Signale, die für die Rekonstruktion der Mikroumgebung des menschlichen Gewebes relevant sind, einschließlich fluidischer Scherung (Strömung), zyklischer Dehnun…

Materials

10x EMEM	Lonza	12-684F	Medium; Stroma
18 Gauge needle	MicroGroup	316H18RW	Tube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard
19 Gauge needle	MicroGroup	316H19RW	Tube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard
2-Stop PharMed BPT	Cole-Palmer	EW-95723-12	Tube, 0.25 mm, 12/pack
70% ethanol and wipes	-	-	For surface sterilization
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP)	Sigma	B7880	Medium supplement
A-83-01	Tocris	2939
Adenine	Sigma	A9795
Advanced DMEM/F12	Thermo	12634010
Airway Epithelial Cells	Lifeline Cell Technology	FC-0016
Aluminum foil	-	-	-
Alveolar cells	Cell Biologics	H6621
Anti-ABCA3	ABCAM	ab24751	Mouse monoclonal antibody [3C9]
Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647	ABCAM	ab215225	Rabbit monoclonal antibody [EPR3747]
Anti-Aquaporin5	ABCAM	ab92320	Rabbit monoclonal antibody [EPR3747]
Anti-beta IV Tubulin	ABCAM	ab11315	Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6]
Anti-CD31 (PECAM-1)	ABCAM	ab9498	Mouse monoclonal [JC/70A] antibody
Anti-CK5	ABCAM	ab75869	Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6]
Anti-Cytokeratin 10	ThermoFisher	MA5-13705	Mouse monoclonal antibody (DE-K10)
Anti-Cytokeratin 14	ABCAM	ab7800	Mouse monoclonal antibody
Anti-E-Cadherin	ABCAM	ab1416	Mouse monoclonal antibody
Anti-Filaggrin	ThermoFisher	PA5-79267	Rabbit polyclonal antibody
Anti-HTI-56	Terrace Biotech	TB-29AHT1-56	Mouse monoclonal antibody (IgG1)
Anti-HTII-280	Terrace Biotech	TB-27AHT2-280	Mouse monoclonal antibody (IgM)
Anti-Involucrin	ThermoFisher	MA5-11803	Mouse monoclonal antibody (SY5)
Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ	Biolengend	618902	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Ki67	ABCAM	ab8191	Mouse monoclonal antibody [B126.1]
Anti-LAMP3	ABCAM	ab111090	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Mature SP-B	Seven Hill	WRAB-48604	Rabbit polyclonal antibody
Anti-MUC5AC	ThermoFisher	PA5-34612	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Mucin-2	SantaCruz Biotechnology	sc-7314	Mouse monoclonal antibody (IgG1)
Anti-p63	Dako	GA662	Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63
Anti-PCNA	ThermoFisher	PA5-32541	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Podoplanin (AT-1α)	ABCAM	ab128994	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B	ABCAM	ab40876	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Surfactant C	Seven Hill	WRAB-9337	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Uteroglobin/SCGB1A1	Hycult Biotech	HM2178	Mouse monoclonal antibody [AY1E6]
Anti-VE-cadherin	ABCAM	ab33168	Rabbit polyclonal antibody
Anti-ZO-1	ThermoFisher	33-9100	Mouse monoclonal antibody [1A12]
Ascorbic acid	Sigma	A4544
Aspirating pipettes	Corning / Falcon	357558	2 mL, polystyrene, individually wrapped
Aspirating tips	-	-	Sterile (autoclaved)
B27	Thermo	17504044
Blocker BSA (10X) in PBS solution	ThermoFisher	37525	Blocker agent
Calcium Chloride	Sigma	C7902
CHIR 99021	Tocris	4423
Collagen I	Advanced Biomatrix	5133	10 mg/mL (Stroma)
Collagen I	Advanced BioMatrix	5005	3 mg/mL (Vascular ECM)
Collagen IV	Sigma	C5533
Collagen-IV	Sigma	C5533-5MG	Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL
Colonic Fibroblasts	Cell Biologics	H6231
Colonic microvascular endothelial cells	Cell Biologics	H6203
Conical tubes	-	-	15 mL and 50 mL polypropylene, sterile
Crosslinker (ER-1)	Emulate	10461	5 mg powder
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	ThermoFisher	D3571	DNA probe
Dermal fibroblasts	ATCC	PCS-201-010
Dermal microvascular endothelial cells	ATCC	CRL-3243
Dexamethasone	Sigma	D4902
DMEM	ThermoFisher	11054020
DMEM/F-12	GIBCO	11320082
DMEM/F-12, GlutaMAX	GIBCO	10565-018	Basal medium for ALI medium
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)	ABCAM	ab150105	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)	ABCAM	ab175472	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	ab150107	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	ABCAM	ab150073	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)	ABCAM	ab175470	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	ab150075	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+)	Corning	21-031-CV	1x
Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coli	PromoCell	C-60170	Medium supplement
F-12 Ham’s	Invitrogen	21700-108	For vascular ECM
FibriCol	Advanced BioMatrix	5133-20ML	Collagen-I solution (10 mg/mL)
Fibronectin	Corning	356008
Fibronectin, Human, Natural,	Corning	47743-654	human plasma fibronectin
Fine-tip precision tweezers	Aven	18056USA	Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers
Glutamax	Invitrogen	21700-108
Glutamax	Invitrogen	35050061
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594)	ABCAM	ab150080	Goat Anti-Mouse secondary antibody
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	ab150115	Goat Anti-Mouse secondary antibody
Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC)	ABCAM	ab6785	Goat Anti-Mouse secondary antibody
Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568	ThermoFisher	A-21124	Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody
Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-21042	Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody
Handheld vacuum aspirator	Corning	4930	-
Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS)	GE Healthcare Life Sciences	SH30066.03
Hemocytometer	-	-	-
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma	H3149
HEPES	Thermo	15630080
Human [Leu15] – Gastrin	Sigma	G9145
Human colonoids	Obtained from clinical resections		Obtained from clinical resections
Human EGF Recombinant Protein	Thermo	PHG0311L
human epithelial growth factor	Thermo	PHG0311
HyClone FetalClone II Serum (U.S.)	GE Healthcare	SH30066.02HI	Sterile FBS heat-inactivated
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt	Sigma	H4881
Hydrocortisone	PromoCell	C-64420	Medium supplement
Ice bucket	-	-	-
Ismatec IPC-N	Cole-Palmer	EW-78000-41	Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips)
ITES	BioWhittaker	17-839Z
Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK	PromoCell	C-63821
Keratinocytes	ATCC	PCS-200-010
Laminin	Biolamina	CT521-0501
Laminin, 521 CTG (CT521)	Biolamina	CT521-0501	human recombinant laminin 521
Lung Fibroblast	Cell Biologics	H6013
Lung Fibroblast	Lifeline Cell Technology	FC-0049
Lung microvascular endothelial cells	Lonza	CC-2527
Lung smooth muscle cells	Lifeline Cell Technology	FC-0046
Manual counter	-	-	-
Masterflex (TPE) Transfer Tubing	Cole-Palmer	FV-96880-02	PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD
Medium 199, no phenol red	Thermo	11043023
Microcentrifuge tube	-	-	1.5 mL, sterile
Microscope (with camera)	-	-	For bright-field imaging
N2	Sigma	17502001
N-acetyl cysteine	Sigma	A5099
Noggin (HEK293T conditioned medium)	Sigma	N17001
Normal Goat Serum	ThermoFisher	50062Z	Blocking solution
O-phosphosrylethanolamine	Sigma	P0503
Paraformaldehyde (4% wt/vol)	EMS	15710	Fixing agent
Penicillin Streptomycin	GIBCO	15140122
Penicillin-streptomycin	Sigma	P4333	10,000 U/mL; 10 mg/mL
Pipette tips	-	-	P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion
Pipette	Gilson	F167380	P20, P200, and P1000
PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement)	AMSBIO (or Thermo)	N/A (or C1910828010)
Poly-L-Lysine coated microscope glass slides	Sigma	P0425	Glass slides
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1
Progesterone	Sigma	P8783
ProLong Gold	ThermoFisher	P36931	Antifade Mountant with DAPI
Retinoic Acid	Sigma	R2625
ROCK inhibitor (Y27632)	Tocris	TB1254-GMP/10
R-spondin (HEK293T conditioned medium)	Sigma	SCC111
SAGM SingleQuots supplements	Lonza	CC-4124
SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM	Lonza	CC-4124	Medium supplements
SB2001190	Tocris	1264/10
Serological pipettes	-	-	2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile
Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM)	Lonza	CC-4124
Solvent Buffer (ER-2)	Emulate	10462	25 mL bottle
Steriflip-HV	Millipore	SE1M003M00	Sterile filtering conical tube
Sterilin 100 mm Square Petri Dishes	Thermo	103	Sterile, 1 per 6 chips
T25 flasks	-	-	-
T75 flasks	-	-	-
Tri-iodothyronine	Sigma	T5516
Triton X-100 (0.3% (vol/vol)	Sigma	T8787	Permeabilization agent
Trypan blue	Sigma	93595	0.4% solution
TrypEE solution	Sigma	12604013	Cell detaching solution
TWEEN-20	Sigma	P2287	Permeabilization agent
UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2)	VWR	21474-598	UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L
Vacuum set-up	-	-	Minimum pressure: -70 kPa
Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coli	PromoCell	C-64420
VEGF-165	PromoCell	C-64420	Medium supplement
Von Willebrand Factor conjugated FITC	ABCAM	ab8822	Sheep polyclonal antibody
Water bath (or beads)	-	-	Set to 37 °C
Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium)	ATCC	CRL-2647