Rekonstituering av cytoarkitektur och funktion hos humana epitelvävnader på ett öppet organchip
Summary
Detta protokoll beskriver kapaciteten och de väsentliga kulturmodaliteterna hos Open-Top Organ-Chip för framgångsrik etablering och mognad av organ-på-chip-kulturer i fulltjocklek av primära vävnader (hud, alveolus, luftvägar och tarm), vilket ger möjlighet att undersöka olika funktionella aspekter av det humana epiteliala / mesenkymala och vaskulära nischgränssnittet in vitro.
Abstract
Nästan alla mänskliga organ är fodrade med epitelvävnader, bestående av ett eller flera lager av tätt anslutna celler organiserade i tredimensionella (3D) strukturer. En av epitelens huvudfunktioner är bildandet av barriärer som skyddar de understrukna vävnaderna mot fysiska och kemiska förolämpningar och smittämnen. Dessutom förmedlar epitel transporten av näringsämnen, hormoner och andra signalmolekyler, vilket ofta skapar biokemiska gradienter som styr cellpositionering och uppdelning i organet. På grund av deras centrala roll för att bestämma organstruktur och funktion är epitel viktiga terapeutiska mål för många mänskliga sjukdomar som inte alltid fångas av djurmodeller. Förutom de uppenbara art-till-art-skillnaderna, är genomförandet av forskningsstudier om barriärfunktion och transportegenskaper hos epitel hos djur ytterligare förvärrat av svårigheten att komma åt dessa vävnader i ett levande system. Medan tvådimensionella (2D) humana cellkulturer är användbara för att svara på grundläggande vetenskapliga frågor, ger de ofta dåliga in vivo-förutsägelser . För att övervinna dessa begränsningar har under det senaste decenniet en uppsjö av mikrokonstruerade biomimetiska plattformar, kända som organ-on-a-chip, framstått som ett lovande alternativ till traditionella in vitro – och djurförsök. Här beskriver vi ett Open-Top Organ-Chip (eller Open-Top Chip), en plattform utformad för modellering av organspecifika epitelvävnader, inklusive hud, lungor och tarmar. Detta chip erbjuder nya möjligheter att rekonstruera den multicellulära arkitekturen och funktionen hos epitelvävnader, inklusive förmågan att återskapa en 3D-stromakomponent genom att införliva vävnadsspecifika fibroblaster och endotelceller i ett mekaniskt aktivt system. Detta Open-Top Chip ger ett oöverträffat verktyg för att studera epiteliala / mesenkymala och vaskulära interaktioner vid flera upplösningsskalor, från enstaka celler till flerskiktiga vävnadskonstruktioner, vilket möjliggör molekylär dissektion av den intercellulära överhörningen av epitelialiserade organ i hälsa och sjukdom.
Introduction
Historiskt sett har forskare förlitat sig på prekliniska djurförsök för läkemedelsupptäckt, men ett växande antal av dessa metoder har ifrågasatts på grund av dålig korrelation med mänskligt resultat1. Implementeringen av “3R” -principerna för att ersätta, minska och förfina djurförsök uppmanar forskare att hitta nya in vitro-alternativa metoder för att stödja preklinisk läkemedels- och kemisk toxikologisk riskbedömning2. Många in vitro-modeller som hittills utvecklats saknar dock den biologiska arkitektur, cellulära komplexitet och mekaniska miljö som krävs för att rekapitulera den dynamiska naturen hos mänskliga levande organ 3,4.
Konventionella in vitro prekliniska system använder vanligtvis 2D-monokulturer av mänskliga celler odlade på en styv plastyta. Dessa metoder ger ett verktyg för att genomföra enkla mekanistiska studier och möjliggör snabb screening av läkemedelskandidater. På grund av sin relativt låga kostnad och höga robusthet paras 2D-modeller ofta ihop med automatiska system med hög genomströmning och används för snabb identifiering av potentiella läkemedelskandidater under det tidiga skedet av läkemedelsutvecklingsprocessen 5,6. Sådana 2D-modeller tillhandahåller emellertid inte ett translationellt tillvägagångssätt för modellering av vävnadsnivå, organnivå eller systemiska svar på terapeutiska kandidater, vilket behövs för exakta förutsägelser av läkemedelssäkerhet och effekt under det prekliniska utvecklingsstadiet. Plancellskulturer rekapitulerar inte den naturliga vävnadsmikromiljön, inklusive det komplexa multicellulära samspelet, biomekaniska egenskaper och tredimensionell (3D) arkitektur hos mänskliga vävnader7. Celler som växer på en plan yta förvärvar ofta inte en mogen fenotyp och kan därför inte svara på farmakologiska stimuli som de skulle göra i den ursprungliga vävnaden. Till exempel uppvisar primära humana alveolära epitelceller som odlas in vitro en skivepitelfenotyp och förlorar viktiga fenotypiska markörer, inklusive ytaktiva proteiner C och B (SP-C och SP-B)8. Förutom otillräcklig differentiering blir primära celler ofta okänsliga för biologiska stressfaktorer in vitro, eftersom vissa biokemiska vägar associerade med vävnadsinflammation blir icke-funktionella9. Sådan förlust av cellfunktion verkar främst vara förknippad med användningen av styva substrat samt bristen på lösliga faktorer som naturligt frigörs av vävnadsspecifika stromaceller såsom lungfibroblaster och glattmuskelceller10,11.
Att förstå att bristen på kemo-fysisk och biologisk komplexitet begränsar cellernas fysiologiska beteende in vitro har främjat utvecklingen av mer sofistikerade multicellulära modeller, som har visat sig bättre fånga komplexiteten hos mänskliga vävnader utanför kroppen12,13. Sedan skapandet av de första samkulturmodellerna i början av 1970-talet14 har introduktionen av syntetiska och naturliga hydrogeler avsevärt förbättrat förmågan att efterlikna inhemska vävnadsmikromiljöer och har blivit ett ovärderligt verktyg för att driva celldifferentiering, styra självorganisationen av celler till vävnadsliknande strukturer och återställande av inhemska vävnadsfunktioner15,16. Till exempel, när de odlas i lämplig 3D-byggnadsställning, kan mänskliga celler självordna sig i funktionella strukturer som sfäroider eller organoider, uttrycka stamcellsmarkörer och kan självförnya17. Däremot åldras mänskliga celler (inklusive stamceller), när de odlas på traditionella 2D-substrat, snabbt och genomgår åldrande efter några passager18. Dessutom kan hydrogeler “skräddarsys” för att matcha specifika vävnadsegenskaper såsom porositet, porstorlek, fibertjocklek, viskoelasticitet, topografi och styvhet eller vidare konstruerade med vävnadshärledda cellulära komponenter och / eller bioaktiva molekyler som möjliggör emulering av fysiologiska eller patologiska tillstånd 19,20. Trots sin enorma potential för läkemedelstestning rekapitulerar 3D-hydrogelbaserade modeller som används i läkemedelsforskning inte fullständigt den komplexa cytoarkitekturen hos in vivo-vävnaderna och saknar viktiga hemodynamiska och mekaniska stimuli som normalt finns i människokroppen, inklusive hydrostatiskt tryck, cyklisk sträckning och vätskeskjuvning21.
Mikrofysiologiska system (MPS) såsom organ-on-chips (OOCs) har nyligen dykt upp som verktyg som kan fånga komplexa fysiologiska svar in vitro22,23. Dessa modeller använder ofta mikrofluidiska plattformar, som möjliggör modellering av den dynamiska mikromiljön hos levande organ.
Vi har kombinerat principerna för 3D-vävnadsbioteknik och mekanobiologi för att skapa en Open-Top Chip-modell av komplex human epitelvävnad. Detta gjorde det möjligt för oss att noggrant rekapitulera den multicellulära och dynamiska mikromiljön hos epitelvävnader. Detta inkluderar vävnadsspecifika biokemiska och biomekaniska signaler som finns naturligt i levande organ men ofta försummas av traditionella in vitro-modeller 24. Open-Top Chip innehåller två fack: ett kärlfack (figur 1A) och ett stromalt fack (figur 1B) åtskilda av ett poröst membran, vilket möjliggör diffusion av näringsämnen mellan de två kamrarna (figur 1C). Det vaskulära facket utsätts för kontinuerligt vätskeflöde för att rekapitulera fysiologisk skjuvspänning, medan stromakammarens töjbara design möjliggör modellering av den mekaniska belastningen i samband med andningsrörelser eller tarmperistaltik. Stromafacket rymmer den avstämbara 3D-hydrogelställningen som är utformad för att stödja den fysiologiska tillväxten av vävnadsspecifika fibroblaster. Den har ett avtagbart lock som underlättar upprättandet av ett luft-vätskegränssnitt, ett tillstånd som möjliggör större emulering av mänsklig fysiologi av slemhinnor samt direkt tillgång till vävnaden för administrering av läkemedel direkt på epitelskiktet. Kompletterande figur 1 fångar några av de viktigaste komponenterna i Open-Top Chip-designen, inklusive dimensioner och biologiska avdelningar (kompletterande figur 1A-D) samt de viktigaste tekniska stegen som beskrivs i detta protokoll (kompletterande figur 1E).
Perfusion av Open-Top Chip uppnås med en programmerbar peristaltisk pump (figur 1D). Den peristaltiska pumpinstallationen gör att 12 Open-Top Chips kan perfuseras samtidigt. De flesta inkubatorer kan rymma två uppsättningar som möjliggör odling av upp till 24 chips per inkubator. Mekanisk sträckning uppnås med hjälp av en skräddarsydd programmerbar vakuumtrycksregulator (figur 1E). Den består av en elektropneumatisk vakuumregulator som styrs elektroniskt av en digital-till-analog-omvandlare. Med andra ord genererar den elektropneumatiska vakuumregulatorn en sinusformad vakuumprofil med en amplitud och frekvens som bestäms av användaren. Cyklisk töjning som sträcker sig från 0% till 15% genereras genom att applicera undertryck på vakuumkanalen hos Open-Top Chip vid en amplitud som sträcker sig från 0 till -90 kPa och en frekvens av 0,2 Hz. Det är ett skräddarsytt system som motsvarar den kommersiellt tillgängliga Flexcell-stamenheten som tidigare antagits och beskrivits i andra artiklar25. För att efterlikna den mekaniska vävnadsdeformation som till exempel associeras med lungans andningsrörelse eller tarmens peristaltik, applicerar det pneumatiska ställdonet sinusformade vakuum-/töjningsvågor vars storlek och amplitud kan justeras för att matcha den fysiologiska nivån av töjning och frekvens som mänskliga celler upplever i sin ursprungliga vävnad.
Här beskriver vi en effektiv och reproducerbar metod för att konstruera och odla organotypiska epitelekvivalenter på en prototyp Open-Top Chip-plattform. Det möjliggör generering av komplexa organmodeller som hud, alveol, luftvägar och tjocktarm samtidigt som det integrerar ett vaskulärt vätskeflöde och mekanisk sträckning. Vi kommer att beskriva viktiga tekniska aspekter som måste beaktas vid implementering av principer för vävnadsteknik för att generera komplexa epitelmodeller. Vi kommer att diskutera fördelarna och eventuella begränsningar med den nuvarande designen.
En översikt över de viktigaste stegen som används för att uppnå vävnads- och organmognad, inklusive flödes- och sträckparametrar, rapporteras i: Figur 2 för huden, Figur 3 för alveolen, Figur 4 för luftvägarna och Figur 5 för tarmen. Ytterligare information om mediernas sammansättning och de reagenser som används för odling av de olika organmodellerna finns i de kompletterande tabellerna (kompletterande tabell 1 för huden; Kompletterande tabell 2 för alveolen; Kompletterande tabell 3 för luftvägarna och kompletterande tabell 4 för tarmen).
Protocol
Representative Results
Discussion
Open-Top Chip representerar en möjliggörande plattform för att undersöka det komplexa cellulära samspelet som uppstår mellan endotel, stroma och epitel i en kontrollerad mikromiljö, i realtid. Denna teknik erbjuder kritiska fördelar jämfört med konventionella organotypiska och organoida kulturer, såsom integration av fysiska och biokemiska signaler som är relevanta för att rekonstruera den mänskliga vävnadsmikromiljön, inklusive fluidisk skjuvning (flöde), cyklisk sträckning och rekonstruktion av epitel…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ingen
Materials
| 10x EMEM | Lonza | 12-684F | Medium; Stroma |
| 18 Gauge needle | MicroGroup | 316H18RW | Tube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard |
| 19 Gauge needle | MicroGroup | 316H19RW | Tube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard |
| 2-Stop PharMed BPT | Cole-Palmer | EW-95723-12 | Tube, 0.25 mm, 12/pack |
| 70% ethanol and wipes | - | - | For surface sterilization |
| 8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP) | Sigma | B7880 | Medium supplement |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| Adenine | Sigma | A9795 | |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo | 12634010 | |
| Airway Epithelial Cells | Lifeline Cell Technology | FC-0016 | |
| Aluminum foil | - | - | - |
| Alveolar cells | Cell Biologics | H6621 | |
| Anti-ABCA3 | ABCAM | ab24751 | Mouse monoclonal antibody [3C9] |
| Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647 | ABCAM | ab215225 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
| Anti-Aquaporin5 | ABCAM | ab92320 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
| Anti-beta IV Tubulin | ABCAM | ab11315 | Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6] |
| Anti-CD31 (PECAM-1) | ABCAM | ab9498 | Mouse monoclonal [JC/70A] antibody |
| Anti-CK5 | ABCAM | ab75869 | Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6] |
| Anti-Cytokeratin 10 | ThermoFisher | MA5-13705 | Mouse monoclonal antibody (DE-K10) |
| Anti-Cytokeratin 14 | ABCAM | ab7800 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-E-Cadherin | ABCAM | ab1416 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-Filaggrin | ThermoFisher | PA5-79267 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-HTI-56 | Terrace Biotech | TB-29AHT1-56 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
| Anti-HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | Mouse monoclonal antibody (IgM) |
| Anti-Involucrin | ThermoFisher | MA5-11803 | Mouse monoclonal antibody (SY5) |
| Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ | Biolengend | 618902 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Ki67 | ABCAM | ab8191 | Mouse monoclonal antibody [B126.1] |
| Anti-LAMP3 | ABCAM | ab111090 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Mature SP-B | Seven Hill | WRAB-48604 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-MUC5AC | ThermoFisher | PA5-34612 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Mucin-2 | SantaCruz Biotechnology | sc-7314 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
| Anti-p63 | Dako | GA662 | Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63 |
| Anti-PCNA | ThermoFisher | PA5-32541 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Podoplanin (AT-1α) | ABCAM | ab128994 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B | ABCAM | ab40876 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Surfactant C | Seven Hill | WRAB-9337 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Uteroglobin/SCGB1A1 | Hycult Biotech | HM2178 | Mouse monoclonal antibody [AY1E6] |
| Anti-VE-cadherin | ABCAM | ab33168 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-ZO-1 | ThermoFisher | 33-9100 | Mouse monoclonal antibody [1A12] |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| Aspirating pipettes | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL, polystyrene, individually wrapped |
| Aspirating tips | - | - | Sterile (autoclaved) |
| B27 | Thermo | 17504044 | |
| Blocker BSA (10X) in PBS solution | ThermoFisher | 37525 | Blocker agent |
| Calcium Chloride | Sigma | C7902 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | |
| Collagen I | Advanced Biomatrix | 5133 | 10 mg/mL (Stroma) |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5005 | 3 mg/mL (Vascular ECM) |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| Collagen-IV | Sigma | C5533-5MG | Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL |
| Colonic Fibroblasts | Cell Biologics | H6231 | |
| Colonic microvascular endothelial cells | Cell Biologics | H6203 | |
| Conical tubes | - | - | 15 mL and 50 mL polypropylene, sterile |
| Crosslinker (ER-1) | Emulate | 10461 | 5 mg powder |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | DNA probe |
| Dermal fibroblasts | ATCC | PCS-201-010 | |
| Dermal microvascular endothelial cells | ATCC | CRL-3243 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11054020 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 11320082 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | Basal medium for ALI medium |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150105 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175472 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150107 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150073 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175470 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150075 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+) | Corning | 21-031-CV | 1x |
| Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-60170 | Medium supplement |
| F-12 Ham’s | Invitrogen | 21700-108 | For vascular ECM |
| FibriCol | Advanced BioMatrix | 5133-20ML | Collagen-I solution (10 mg/mL) |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Fibronectin, Human, Natural, | Corning | 47743-654 | human plasma fibronectin |
| Fine-tip precision tweezers | Aven | 18056USA | Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers |
| Glutamax | Invitrogen | 21700-108 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050061 | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594) | ABCAM | ab150080 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150115 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC) | ABCAM | ab6785 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-21124 | Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21042 | Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody |
| Handheld vacuum aspirator | Corning | 4930 | - |
| Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30066.03 | |
| Hemocytometer | - | - | - |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149 | |
| HEPES | Thermo | 15630080 | |
| Human [Leu15] – Gastrin | Sigma | G9145 | |
| Human colonoids | Obtained from clinical resections | Obtained from clinical resections | |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo | PHG0311L | |
| human epithelial growth factor | Thermo | PHG0311 | |
| HyClone FetalClone II Serum (U.S.) | GE Healthcare | SH30066.02HI | Sterile FBS heat-inactivated |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma | H4881 | |
| Hydrocortisone | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
| Ice bucket | - | - | - |
| Ismatec IPC-N | Cole-Palmer | EW-78000-41 | Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips) |
| ITES | BioWhittaker | 17-839Z | |
| Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK | PromoCell | C-63821 | |
| Keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 | |
| Laminin | Biolamina | CT521-0501 | |
| Laminin, 521 CTG (CT521) | Biolamina | CT521-0501 | human recombinant laminin 521 |
| Lung Fibroblast | Cell Biologics | H6013 | |
| Lung Fibroblast | Lifeline Cell Technology | FC-0049 | |
| Lung microvascular endothelial cells | Lonza | CC-2527 | |
| Lung smooth muscle cells | Lifeline Cell Technology | FC-0046 | |
| Manual counter | - | - | - |
| Masterflex (TPE) Transfer Tubing | Cole-Palmer | FV-96880-02 | PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD |
| Medium 199, no phenol red | Thermo | 11043023 | |
| Microcentrifuge tube | - | - | 1.5 mL, sterile |
| Microscope (with camera) | - | - | For bright-field imaging |
| N2 | Sigma | 17502001 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | A5099 | |
| Noggin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | N17001 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher | 50062Z | Blocking solution |
| O-phosphosrylethanolamine | Sigma | P0503 | |
| Paraformaldehyde (4% wt/vol) | EMS | 15710 | Fixing agent |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333 | 10,000 U/mL; 10 mg/mL |
| Pipette tips | - | - | P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion |
| Pipette | Gilson | F167380 | P20, P200, and P1000 |
| PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement) | AMSBIO (or Thermo) | N/A (or C1910828010) | |
| Poly-L-Lysine coated microscope glass slides | Sigma | P0425 | Glass slides |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| ProLong Gold | ThermoFisher | P36931 | Antifade Mountant with DAPI |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| ROCK inhibitor (Y27632) | Tocris | TB1254-GMP/10 | |
| R-spondin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | SCC111 | |
| SAGM SingleQuots supplements | Lonza | CC-4124 | |
| SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM | Lonza | CC-4124 | Medium supplements |
| SB2001190 | Tocris | 1264/10 | |
| Serological pipettes | - | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile |
| Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM) | Lonza | CC-4124 | |
| Solvent Buffer (ER-2) | Emulate | 10462 | 25 mL bottle |
| Steriflip-HV | Millipore | SE1M003M00 | Sterile filtering conical tube |
| Sterilin 100 mm Square Petri Dishes | Thermo | 103 | Sterile, 1 per 6 chips |
| T25 flasks | - | - | - |
| T75 flasks | - | - | - |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T5516 | |
| Triton X-100 (0.3% (vol/vol) | Sigma | T8787 | Permeabilization agent |
| Trypan blue | Sigma | 93595 | 0.4% solution |
| TrypEE solution | Sigma | 12604013 | Cell detaching solution |
| TWEEN-20 | Sigma | P2287 | Permeabilization agent |
| UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2) | VWR | 21474-598 | UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L |
| Vacuum set-up | - | - | Minimum pressure: -70 kPa |
| Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-64420 | |
| VEGF-165 | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
| Von Willebrand Factor conjugated FITC | ABCAM | ab8822 | Sheep polyclonal antibody |
| Water bath (or beads) | - | - | Set to 37 °C |
| Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium) | ATCC | CRL-2647 |
Riferimenti
- Van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach. JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).
- Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L. Implementation of the principles of the 3Rs of animal testing at CDER: Past, present and future. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 123, 104953 (2021).
- Mosig, A. S. Organ-on-chip models: New opportunities for biomedical research. Future Science OA. 3 (2), (2017).
- Alépée, N., et al. State-of-the-art of 3D cultures (organs-on-a-chip) in safety testing and pathophysiology. Altex. 31 (4), 441-477 (2014).
- MacArron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
- Hughes, J. P., Rees, S. S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Cell culture based in vitro test systems for anticancer drug screening. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 322 (2020).
- Mao, P., et al. Human alveolar epithelial type II cells in primary culture. Physiological Reports. 3 (2), 12288 (2015).
- Zaitseva, M., Vollenhoven, B. J., Rogers, P. A. W. In vitro culture significantly alters gene expression profiles and reduces differences between myometrial and fibroid smooth muscle cells. Molecular Human Reproduction. 12 (3), 187-207 (2006).
- Singh, A., Brito, I., Lammerding, J. Beyond tissue stiffness and bioadhesivity: Advanced biomaterials to model tumor microenvironments and drug resistance. Trends in Cancer. 4 (4), 281-291 (2018).
- Nawroth, J. C., et al. Stem cell-based Lung-on-Chips: The best of both worlds. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 12-32 (2019).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Sutherland, R. M., Inch, W. R., McCredie, J. A., Kruuv, J. A multi-component radiation survival curve using an in vitro tumour model. International Journal of Radiation Biology. 18 (5), 491-495 (1970).
- Chandra, P., Lee, S. J. Synthetic extracellular microenvironment for modulating stem cell behaviors. Biomarker Insights. 10, 105-116 (2015).
- Nicolas, J., et al. 3D extracellular matrix mimics: Fundamental concepts and role of materials chemistry to influence stem cell fate. Biomacromolecules. 21 (6), 1968-1994 (2020).
- Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
- Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
- Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323 (2019).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Li, H., et al. Biomechanical cues as master regulators of hematopoietic stem cell fate. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 5881-5902 (2021).
- Donoghue, L., Nguyen, K. T., Graham, C., Sethu, P. Tissue chips and microphysiological systems for disease modeling and drug testing. Micromachines. 12 (2), 139 (2021).
- Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
- Varone, A., et al. A novel organ-chip system emulates three-dimensional architecture of the human epithelia and the mechanical forces acting on it. Biomaterials. 275, 120957 (2021).
- Hassell, B. A., et al. Human organ chip models recapitulate orthotopic lung cancer growth, therapeutic responses, and tumor dormancy in vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
- Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Biobanking. 1897, 253-268 (2019).
- Grant, J., et al. Simulating drug concentrations in PDMS microfluidic organ chips. Lab on a Chip. 21 (18), 3509-3519 (2021).
- Barrile, R., et al. Organ-on-chip recapitulates thrombosis Induced by an anti-CD154 monoclonal antibody: Translational potential of advanced microengineered systems. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 104 (6), 1240-1248 (2018).
- Jain, A., et al. Primary human lung alveolus-on-a-chip model of intravascular thrombosis for assessment of therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
- Campbell, S. B., Wu, Q., Yazbeck, J., Liu, C., Okhovatian, S., Radisic, M. Beyond polydimethylsiloxane: Alternative materials for fabrication of organ-on-a-chip devices and microphysiological systems. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (7), 2880-2899 (2021).
- Pun, S., Haney, L. C., Barrile, R. Modelling human physiology on-chip: Historical perspectives and future directions. Micromachines. 12 (10), 1250 (2021).
