Summary

コケ物理におけるカルコフルーアを用いた細胞壁動態の3次元タイムラプスイメージング

Published: February 10, 2023
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Summary

本論文は、生きたコケ組織の3次元細胞壁動態を画像化するための詳細なプロトコルを提示し、長期間にわたる発生中の野生型における ggb 変異体の細胞壁の剥離と肥厚する細胞壁パターンの可視化を可能にします。

Abstract

蛍光顕微鏡によるタイムラプスイメージングにより、細胞および細胞内レベルでの成長と発達の動的な変化を観察できます。一般に、長期間にわたる観察のために、この技術は蛍光タンパク質の形質転換を必要とする。ただし、ほとんどのシステムでは、遺伝子形質転換には時間がかかるか、技術的に利用できません。この原稿は、コケの Physcomitrium patensで開発されたカルコフルオロ色素(植物細胞壁のセルロースを染色する)を使用して、3日間にわたる細胞壁ダイナミクスの3Dタイムラプスイメージングのプロトコルを提示します。細胞壁からのカルコフルオール色素シグナルは安定しており、明らかな崩壊なしに1週間持続します。この方法を使用して、 ggb 変異体(タンパク質ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ-Iベータサブユニットがノックアウトされている)における細胞の剥離は、調節されていない細胞増殖および細胞壁完全性の欠陥によって引き起こされることが示されている。さらに、カルコフルアー染色のパターンは時間とともに変化します。それほど強く染色されていない領域は、野生型の将来の細胞増殖/分岐部位と相関しています。この方法は、細胞壁を含み、calcofluorによって染色することができる他の多くのシステムに適用することができます。

Introduction

植物細胞壁は、細胞の拡大と発生の間に動的な変化を受けます1,2,3細胞壁の完全性を維持することは、成長および発生中の植物細胞の接着、および環境シグナルへの応答にとって重要です。発生中の細胞接着や環境変化への適応を理解するためには、生細胞の細胞壁動態を長期間可視化することが重要ですが、細胞壁動態を直接観察する方法は依然として課題です。

細胞変化のタイムラプスイメージングは、高解像度蛍光顕微鏡4,5,6,7を用いて生物の有益な発生動態を提供することができるタイムラプス3Dイメージングは、成長および発生中の細胞形状の動的変化を研究するための大きな可能性を秘めていますが、この技術は通常、蛍光タンパク質の形質転換を必要とします4,5,6,7ただし、ほとんどのシステムでは、遺伝子変換には時間がかかるか、技術的に困難です。代替として、細胞成分に付着する蛍光色素が長い間利用可能であった。蛍光色素は、特定の波長の光を照射した後に蛍光を発することができる。一般的な例は、Edu、DAPI、PI、FM4-64、およびカルコフルーアホワイト8,9,10です。しかしながら、1つの大きな欠点は、これらの色素が細胞に害を及ぼすこともあり、通常、固定組織または短時間の実験にしか使用できないことである8910

ここに示すプロトコルでは、コケP.パテンのタイムラプス実験中にカルコフルーアホワイトが培地内に混合されると、カルコフルーア信号は安定しています。この方法を用いて、3Dタイムラプスイメージングを用いてggb変異体における細胞の剥離を3日間にわたって観察した(図1)。この方法は、細胞壁を含み、calcofluorによって染色することができる他の多くのシステムに適用することができます。

Protocol

注意: 材料と機器のリストについては 材料の 表を、このプロトコルで使用されるソリューションのリストについては 表1 を参照してください。 1.ガラス底皿用植物の準備 BCDAT寒天培地中のコケ原始組織を、一定の白色光(~50 μmol m-2 s-1)下で13 cmシャーレ中で、成長チャンバー内で25°Cで7日間成長させます。 …

Representative Results

この方法により、野生型および ggb 変異体の発生過程における細胞壁動態の観察が可能となります(図1)。その結果、細胞壁の肥厚が少ない領域は細胞増殖・分岐部位と相関し、野生型の増殖・分岐部位の予測が可能となりました(図1A)。 ggb 変異体の細胞壁の表面は、制御されない細胞増殖のために発生中に引き裂かれました<sup class="xr…

Discussion

タイムラプス3D再構成、または4Dイメージングは、発生過程における細胞形態のダイナミクスを観察するための強力なツールです。このプロトコールでは、カルコフルオールホワイトを培地に混合することにより、コケ P.パテンの3D細胞形態の動態を観察することができます。この方法を用いて、 ggb 変異体の細胞壁の表面が発生中に引き裂かれることを観察しまし?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、共焦点顕微鏡の支援について、ルイビル大学のSoucy Patricia博士とBetty Nunn博士に感謝の意を表している。この研究は、全米科学財団(1456884からMPR)および全米科学財団協力協定(1849213からMPR)によって資金提供されました。

Materials

3-mm-thick red plastic light filter  Mitsubishi  no.102
27 mm diameter glass base dish  Iwaki 3930-035
Agar  Sigma A6924
Calcofluor white   Sigma 18909-100ML-F Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L
Confocal microscope  Nikon  A1

NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/en_AOM/products/software/nis-elements/viewer

Fluorescence microscope  Nikon  TE200  Equipped with a DS-U3 camera;
Gellan gum  Nacali Tesque 12389-96
Plant Growth Chambers SANYO  Sanyo MLR-350H
Sterilized syringe 0.22 μm filter Millipore SLGV033RS

Riferimenti

  1. Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
  2. Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment. Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).
  3. Bao, L., et al. The cellular function of ROP GTPase prenylation important for multicellularity in the moss Physcomitrium patens. Development. 149 (12), (2022).
  4. Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
  5. Fang, Y., Spector, D. L. Live cell imaging of plants. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), (2010).
  6. Goh, T. Long-term live-cell imaging approaches to study lateral root formation in Arabidopsis thaliana. Microscopy. 68 (1), 4-12 (2019).
  7. Hamant, O., Das, P., Burian, A. Time-lapse imaging of developing shoot meristems using a confocal laser scanning microscope. Methods in Molecular Biology. 1992, 257-268 (2019).
  8. Rigal, A., Doyle, S. M., Robert, S. Live cell imaging of FM4-64, a tool for tracing the endocytic pathways in Arabidopsis root cells. Methods in Molecular Biology. 1242, 93-103 (2015).
  9. Yagi, N., et al. Advances in synthetic fluorescent probe labeling for live-cell imaging in plants. Plant & Cell Physiology. 62 (8), 1259-1268 (2021).
  10. Whitewoods, C. D., et al. CLAVATA was a genetic novelty for the morphological innovation of 3D growth in land plants. Current Biology. 28 (15), 2365-2376 (2018).
  11. Bao, L., et al. A PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase controls light responses in land plants. Science Advances. 8 (4), 2116 (2022).

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Citazione di questo articolo
Bao, L., Running, M. P. 3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens. J. Vis. Exp. (192), e64651, doi:10.3791/64651 (2023).

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