创新的 3D 打印插入物，旨在实现简单的 2D 和 3D 细胞培养
Summary
在本文中，提出了一种新设计的3D打印插入物作为共培养模型，并通过研究内皮细胞和角质形成细胞之间的旁分泌细胞间通讯进行了验证。
Abstract
不同细胞类型之间间接通讯的经典分析需要使用条件培养基。此外，条件培养基的生产仍然耗时，并且远离生理和病理条件。尽管市场上有几种共培养模型，但它们仍然仅限于特定的测定，并且主要用于两种类型的细胞。
在这里，使用了与多种功能测定兼容的3D打印插入物。插入物允许将 6 孔板的一个孔分离成四个隔室。可以设置多种组合。此外，在隔室的每个壁上都设计了窗口，以便在培养基中以体积依赖性的方式在每个隔间之间实现潜在的细胞间通信。例如，可以在单层、3D（微球）或两者结合的四种细胞类型之间研究旁分泌细胞间通讯。此外，可以将不同细胞类型的混合物以2D或3D（类器官）格式接种在同一隔室中。3D打印插入物中没有底部，因此可以在板上进行通常的培养条件，在包含插入物的板上进行可能的涂层，并通过光学显微镜直接可视化。多个隔室提供了独立收集不同细胞类型的可能性，也可以在每个隔室中使用不同的试剂进行RNA或蛋白质提取。在这项研究中，提供了使用新的3D打印插入物作为共培养系统的详细方法。为了证明这种灵活而简单的模型的几种能力，在新的3D打印插入物中进行了先前发表的细胞通讯功能测定，并被证明是可重复的。3D打印插入物和使用条件培养基的传统细胞培养物导致了类似的结果。总之，3D打印插入物是一种简单的设备，可以适应与贴壁细胞类型的多种共培养模型。
Introduction
在体内，细胞直接（细胞接触）或间接（通过分子分泌）相互交流。为了研究细胞通讯，可以开发不同的共培养模型，例如直接共培养（不同的细胞类型在同一孔中直接相互作用）和区室共培养（不同的细胞类型在培养系统的不同隔室中间接相互作用）1。此外，条件培养基可用于共培养系统，其中间接相互作用是通过将效应细胞类型的条件培养基中包含的分泌分子转移到1型应答细胞来实现的。
在旁分泌细胞通讯研究的情况下，间接共培养系统提供了强烈反映体内细胞相互作用的模型。间接共培养系统已经开发并商业化，允许建立间接共培养模式2,3。不幸的是，大多数间接共培养系统仅提供两个隔室。其他间接共培养系统提供多个隔室，但与本手稿中报告的系统相比，它们的可扩展性较差。其中一些不允许在显微镜下进行经典的可视化，并且它们通常提供特定的应用方法。在几项研究中，不同细胞类型之间的旁分泌通讯由条件培养基模型4,5,6,7探测。与间接共培养系统相比，这是一种更简单的研究方法，因为它不需要建立特定的方法或材料1.另一方面，条件培养基的制备非常耗时，并且仅提供有关单向细胞信号传导（效应器到应答器）的信息1。
在本文中，提出了一种新的、简单的研究细胞通讯的方法。打印的插入物允许以直接或间接相互作用以及2D或3D格式组合多种细胞类型，为轻松建立共培养模型提供了许多优势。适合放置在6孔板的孔中，3D打印插入物是圆形的，可以将孔分成四个隔室（两个大隔室和两个小隔室; 图1A）。3D打印插件的特点是没有底部。因此，细胞与放置插入物的板直接接触。此外，每个隔间都可以独立于其他隔间进行涂层。此外，在光学显微镜下可以轻松跟踪细胞行为。插入物每壁中存在通信窗口，允许在最佳时间添加公共培养基以执行不同的共培养实验。可以进行多种共培养组合，以研究几种细胞类型之间的直接和/或间接通讯。例如，可以设计单层和/或3D（球状体）中四种不同细胞类型之间的间接共培养模型。直接和间接共培养模型的组合也可以通过在同一隔室中混合不同的细胞类型来进行。复杂结构（类器官、组织外植体等）对不同细胞类型的影响可能是可以建立模型的另一个例子。此外，3D打印插入片段与细胞生物学功能测定（增殖，迁移，假管形成，分化等）和生物化学测试（提取DNA，RNA，蛋白质，脂质等）兼容。最后，3D打印的插入物提供了广泛的共培养模型实验方案，可以在不同隔室的同一实验中同时组合不同的测定。
提出了3D打印插入物的一些容量，以验证它们是否是一种快速且易于使用的共培养模型。与先前发表的关于旁分泌细胞通讯的研究相比，3D打印插入物能够成为有价值的共培养模型。为了评估这一点，比较了3D打印插入系统和使用条件培养基的经典系统之间的角质形成细胞对内皮细胞增殖和迁移的调节。与使用条件介质的传统系统相比，3D打印的插入物可以快速获得类似的结果。事实上，3D打印的插入物提供了一个强大的模型来研究两个方向的细胞相互作用，而无需产生条件培养基，并且有可能在同一实验中并行进行增殖和迁移测定。
最后，本文提出了一种新的、即用型的细胞通讯研究模型。3D打印插入片段与所有贴壁细胞类型兼容，允许进行多种共培养组合，旨在更接近 体内 条件。
Protocol
Representative Results
Discussion
通常使用条件培养基或共培养系统设备研究间接细胞通讯。在实验的上游，条件培养基制备非常耗时，并且该方法仅限于单侧效应分析。科林-皮埃尔等人的先前研究。使用条件培养基对两种细胞类型（HDMEC和KORS）之间的间接细胞通讯进行了8次。先前研究的数据证明了KORS条件培养基对HDMEC增殖的影响以及KORS条件培养基对HDMEC迁移，假管形成和GPC1表达的影响</su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究是与巴斯夫美容护理解决方案合作完成的。Charlie Colin-Pierre女士是巴斯夫/CNRS资助的博士研究员。
我们要感谢Mehdi Sellami先生构思3D打印插件。
Materials
| Autoclave | Getinge | APHP | Solid cycle, 121 °C for 20 min |
| Biomed Clear | Formlabs | RS-F2-BMCL-01 | Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France) |
| Cell culture detergents | Tounett | A18590/0116 | |
| Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche | 11,64,48,07,001 | |
| Counting slide | NanoEnTek | EVE-050 | |
| Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm | Ibidi | 80206 | two-migration chambers device. |
| Endothelial cell medium | ScienCell | 1001 | Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503). |
| EVE Automated cell counter | NanoEnTek | NESCT-EVE-001E | |
| EVOS XL Core | Fisher Scientific | AMEX1200 | 10x of magnification |
| Food silicon reagent and catalyst kit | Artificina | RTV 3428 A and B | (10:1) |
| FORM 3B printer | Formlabs | PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC | Impression performed by 3D-Morphoz company |
| Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC) | ScienCell | 2000 | |
| Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS ) | ScienCell | 2420 | |
| Macro Wound Healing Tool Software | ImageJ | Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays) | |
| Mesenchymal stem cell medium | ScienCell | 7501 | Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503) |
| Microplate reader SPECTRO star NANO | BMG Labtech | BMG LABTECH software | |
| PBS | Promocell | C-40232 | Without Ca2+ / Mg2+ |
| Trypan Blue Stain | NanoEnTek | EBT-001 | |
| Trypsin / EDTA | Promocell | C-41020 | Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature |
| 96-well plate Nunclon Delta Surface | Thermoscientific | 167008 |
Riferimenti
- Regier, M. C., Alarid, E. T., Beebe, D. J. Progress towards understanding heterotypic interactions in multi-culture models of breast cancer. Integrative Biology. 8 (6), 684-692 (2016).
- Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions. Journal of Visualized Experiments. (143), e58825 (2019).
- Lin, J., et al. Long non-coding RNA UBE2CP3 enhances HCC cell secretion of VEGFA and promotes angiogenesis by activating ERK1/2/HIF-1α/VEGFA signalling in hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 113 (2018).
- Soares, N. L., et al. Carbon monoxide modulation of microglia-neuron communication: Anti-neuroinflammatory and neurotrophic role. Molecular Neurobiology. 59 (2), 872-889 (2022).
- Al Halawani, A., Abdulkhalek, L., Mithieux, S. M., Weiss, A. S. Tropoelastin promotes the formation of dense, interconnected endothelial networks. Biomolecules. 11 (9), 1318 (2021).
- Mercatali, L., et al. Development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).
- Orona, N. S., Astort, F., Maglione, G. A., Yakisich, J. S., Tasat, D. R. Direct and indirect effect of air particles exposure induce Nrf2-dependent cardiomyocyte cellular response in vitro. Cardiovascular Toxicology. 19 (6), 575-587 (2019).
- Colin-Pierre, C., et al. The glypican-1/HGF/C-met and glypican-1/VEGF/VEGFR2 ternary complexes regulate hair follicle angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 781172 (2021).
- Toubal, A., et al. The NC1 domain of type XIX collagen inhibits melanoma cell migration. European Journal of Dermatology. 20 (6), 712-718 (2010).
- Wu, A. -. L., et al. Role of growth factors and internal limiting membrane constituents in müller cell migration. Experimental Eye Research. 202, 108352 (2021).
- Oudart, J. -. B., et al. Plasmin releases the anti-tumor peptide from the NC1 domain of collagen XIX. Oncotarget. 6 (6), 3656-3668 (2015).
- Martinotti, S., Ranzato, E. Scratch wound healing assay. Methods in Molecular Biology. 2109, 225-229 (2020).
- Cattin, S., Ramont, L., Rüegg, C. Characterization and in vivo validation of a three-dimensional multi-cellular culture model to study heterotypic interactions in colorectal cancer cell growth, invasion and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 97 (2018).
- Ma, Y. N., et al. Three-dimensional spheroid culture of adipose stromal vascular cells for studying adipogenesis in beef cattle. Animal. 12 (10), 2123-2129 (2018).
