ملحق مبتكر مطبوع ثلاثي الأبعاد مصمم لتمكين ثقافات الخلايا 2D و 3D المباشرة
Summary
في هذه الورقة ، يتم تقديم ملحق مطبوع 3D مصمم حديثا كنموذج للثقافة المشتركة ويتم التحقق من صحته من خلال دراسة الاتصال بين الخلايا بين الخلايا البطانية والخلايا الكيراتينية.
Abstract
تتطلب التحليلات الكلاسيكية للاتصال غير المباشر بين أنواع الخلايا المختلفة استخدام وسائط مشروطة. علاوة على ذلك ، لا يزال إنتاج الوسائط المكيفة يستغرق وقتا طويلا وبعيدا عن الظروف الفسيولوجية والمرضية. على الرغم من توفر عدد قليل من نماذج الاستزراع المشترك تجاريا ، إلا أنها تظل مقتصرة على فحوصات محددة وهي في الغالب لنوعين من الخلايا.
هنا ، يتم استخدام إدخالات مطبوعة 3D متوافقة مع العديد من المقايسات الوظيفية. يسمح الملحق بفصل بئر واحد من لوحة 6 آبار إلى أربع مقصورات. يمكن تعيين مجموعة واسعة من المجموعات. علاوة على ذلك ، تم تصميم النوافذ في كل جدار من المقصورات بحيث يكون الاتصال المحتمل بين الخلايا بين كل حجرة ممكنا في وسط الاستزراع بطريقة تعتمد على الحجم. على سبيل المثال ، يمكن دراسة الاتصال بين الخلايا paracrine بين أربعة أنواع من الخلايا في طبقة واحدة ، في 3D (كروية) ، أو عن طريق الجمع بين الاثنين معا. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن زرع مزيج من أنواع الخلايا المختلفة في نفس الحجرة بتنسيق 2D أو 3D (عضويات). يسمح عدم وجود قاع في الإدخالات المطبوعة 3D بظروف الثقافة المعتادة على اللوحة ، والطلاء المحتمل على اللوحة التي تحتوي على الإدراج ، والتصور المباشر بواسطة الفحص المجهري الضوئي. توفر المقصورات المتعددة إمكانية جمع أنواع مختلفة من الخلايا بشكل مستقل أو استخدام ، في كل حجرة ، كواشف مختلفة لاستخراج الحمض النووي الريبي أو البروتين. في هذه الدراسة ، يتم توفير منهجية مفصلة لاستخدام إدراج 3D المطبوع الجديد كنظام ثقافة مشتركة. لإثبات العديد من قدرات هذا النموذج المرن والبسيط ، تم إجراء فحوصات وظيفية منشورة مسبقا للاتصال الخلوي في إدخالات 3D المطبوعة الجديدة وثبت أنها قابلة للتكرار. أدت الإدخالات المطبوعة 3D وثقافة الخلية التقليدية باستخدام الوسائط المكيفة إلى نتائج مماثلة. في الختام ، فإن الإدراج المطبوع 3D هو جهاز بسيط يمكن تكييفه مع العديد من نماذج الثقافات المشتركة مع أنواع الخلايا الملتصقة.
Introduction
في الجسم الحي ، تتواصل الخلايا مع بعضها البعض إما بشكل مباشر (اتصال الخلية) أو بشكل غير مباشر (عن طريق إفراز الجزيئات). لدراسة التواصل الخلوي ، يمكن تطوير نماذج مختلفة للثقافة المشتركة ، مثل الثقافة المشتركة المباشرة (أنواع الخلايا المختلفة في تفاعل مباشر في نفس البئر) والثقافة المشتركة المجزأة (أنواع الخلايا المختلفة في تفاعل غير مباشر في أجزاء مختلفة من نظام الاستزراع) 1. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام الوسائط المشروطة لأنظمة الاستزراع المشترك ، حيث يتم تمكين التفاعل غير المباشر بواسطة جزيئات مفرزة موجودة في الوسائط المشروطة لنوع خلية مستجيبة يتم نقلها إلى نوع خلية مستجيبةمن النوع 1.
في حالة دراسات اتصالات الخلايا الباراكرين ، توفر أنظمة الزراعة المشتركة غير المباشرة نماذج تعكس بقوة تفاعلات الخلايا في الجسم الحي. تم تطوير أنظمة الثقافة المشتركة غير المباشرة وتسويقها ، مما يسمح بإنشاء نماذج الثقافة المشتركةغير المباشرة 2,3. لسوء الحظ ، توفر معظم أنظمة الثقافة المشتركة غير المباشرة جزأين فقط. توفر أنظمة الثقافة المشتركة غير المباشرة الأخرى مقصورات متعددة ، لكنها أقل قابلية للتطوير مقارنة بالنظام المذكور في هذه المخطوطة. بعضها لا يسمح بالتصور الكلاسيكي تحت المجهر ، وغالبا ما يقدمون طرق تطبيق محددة. في العديد من الدراسات ، يتم فحص اتصال paracrine بين أنواع الخلايا المختلفة بواسطة نموذج الوسائط المشروطة4،5،6،7. هذه طريقة أسهل للتحقيق مقارنة بأنظمة الثقافة المشتركة غير المباشرة لأنها لا تتطلب طرقا أو مواد محددة ليتم إنشاؤها1. من ناحية أخرى ، فإن إعداد الوسائط المكيفة يستغرق وقتا طويلا ويوفر معلومات فقط عن إشارات الخلية أحادية الاتجاه (المستجيب إلى المستجيب)1.
في هذه الورقة ، تم اقتراح طريقة جديدة وبسيطة للتحقيق في اتصال الخلية. السماح بالجمع بين عدة أنواع من الخلايا في التفاعل المباشر أو غير المباشر وفي تنسيقات 2D أو 3D ، تقدم الإدخالات المطبوعة العديد من المزايا لإعداد نماذج الثقافة المشتركة بسهولة. تم تكييفها ليتم وضعها في آبار 6 ألواح من 6 آبار ، والملحق المطبوع 3D دائري ويسمح بفصل البئر إلى أربع حجرات (مقصورتان كبيرتان ومقصورتان صغيرتان. الشكل 1 أ). تتميز الإدخالات المطبوعة 3D بعدم وجود قاع. وبالتالي ، فإن الخلايا على اتصال مباشر مع اللوحة التي يتم وضع الإدخال عليها. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن طلاء كل حجرة بشكل مستقل عن الآخرين. علاوة على ذلك ، يمكن متابعة سلوك الخلية بسهولة تحت المجاهر الضوئية. يسمح وجود نوافذ اتصال في كل جدار من الإدراج بإضافة ، في الوقت الأمثل ، وسيط مشترك لإجراء تجارب مختلفة للثقافة المشتركة. يمكن إجراء مجموعات عديدة من الثقافة المشتركة لدراسة الاتصال المباشر و / أو غير المباشر بين عدة أنواع من الخلايا. على سبيل المثال ، يمكن تصميم نموذج للثقافة المشتركة غير المباشرة بين أربعة أنواع مختلفة من الخلايا في طبقة واحدة و / أو في 3D (كروية). يمكن أيضا إجراء مجموعة من نماذج الاستزراع المشترك المباشرة وغير المباشرة عن طريق خلط أنواع مختلفة من الخلايا في نفس الحجرة. يمكن أن يكون تأثير الهياكل المعقدة (المواد العضوية ، وزرع الأنسجة ، وما إلى ذلك) على أنواع الخلايا المختلفة مثالا آخر على النماذج التي يمكن صنعها. علاوة على ذلك ، فإن الإدخالات المطبوعة 3D متوافقة مع المقايسات الوظيفية لبيولوجيا الخلية (الانتشار ، الهجرة ، تكوين الأنبوب الكاذب ، التمايز ، إلخ) ومع اختبارات الكيمياء الحيوية (استخراج الحمض النووي ، الحمض النووي الريبي ، البروتين ، الدهون ، إلخ). أخيرا ، توفر الإدخالات المطبوعة 3D مجموعة واسعة من المخططات التجريبية لنماذج الثقافة المشتركة مع إمكانية الجمع بين المقايسات المختلفة في وقت واحد في نفس التجربة في المقصورات المختلفة.
يتم تقديم بعض قدرات الإدخالات المطبوعة 3D للتحقق من صحتها كنموذج ثقافة مشتركة سريع وسهل الاستخدام. بالمقارنة مع دراسة نشرت سابقا أجريت على اتصالات الخلايا paracrine ، تم إثبات قدرة إدراج 3D المطبوعة لتكون نموذجا قيمة للثقافة المشتركة. لتقييم هذه النقطة ، تمت مقارنة تنظيم تكاثر الخلايا البطانية والهجرة بواسطة الخلايا الكيراتينية بين نظام الإدراج المطبوع 3D والنظام الكلاسيكي باستخدام الوسائط المشروطة. تسمح الإدخالات المطبوعة 3D بالحصول على نتائج مماثلة بسرعة مقارنة بالنظام التقليدي باستخدام الوسائط المكيفة. في الواقع ، توفر الإدخالات المطبوعة 3D نموذجا قويا لدراسة تفاعلات الخلايا في كلا الاتجاهين دون الحاجة إلى إنتاج وسائط مشروطة ومع إمكانية إجراء فحوصات الانتشار والهجرة بالتوازي في نفس التجربة.
في الختام ، في هذه الورقة ، يقترح نموذج جديد وجاهز للاستخدام لدراسة اتصال الخلية. متوافقة مع جميع أنواع الخلايا الملتصقة ، تسمح الإدخالات المطبوعة 3D بأداء مجموعات عديدة من الثقافة المشتركة التي تهدف إلى أن تكون أقرب إلى ظروف الجسم الحي .
Protocol
Representative Results
Discussion
عادة ما يتم التحقيق في الاتصال الخلوي غير المباشر باستخدام الوسائط المكيفة أو أجهزة نظام الثقافة المشتركة. يستغرق تحضير الوسائط المشروطة وقتا طويلا في المراحل الأولى من التجارب ، وتقتصر هذه الطريقة على تحليلات التأثير من جانب واحد. الدراسة السابقة التي أجراها كولين بيير وآخرون.<sup cla…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم إجراء هذه الدراسة بالتعاون مع BASF Beauty Care Solutions. السيدة تشارلي كولين بيير هي زميلة دكتوراه ممولة من BASF / CNRS.
نود أن نشكر السيد مهدي سلامي على تصور إدراج 3D المطبوعة.
Materials
| Autoclave | Getinge | APHP | Solid cycle, 121 °C for 20 min |
| Biomed Clear | Formlabs | RS-F2-BMCL-01 | Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France) |
| Cell culture detergents | Tounett | A18590/0116 | |
| Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche | 11,64,48,07,001 | |
| Counting slide | NanoEnTek | EVE-050 | |
| Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm | Ibidi | 80206 | two-migration chambers device. |
| Endothelial cell medium | ScienCell | 1001 | Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503). |
| EVE Automated cell counter | NanoEnTek | NESCT-EVE-001E | |
| EVOS XL Core | Fisher Scientific | AMEX1200 | 10x of magnification |
| Food silicon reagent and catalyst kit | Artificina | RTV 3428 A and B | (10:1) |
| FORM 3B printer | Formlabs | PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC | Impression performed by 3D-Morphoz company |
| Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC) | ScienCell | 2000 | |
| Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS ) | ScienCell | 2420 | |
| Macro Wound Healing Tool Software | ImageJ | Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays) | |
| Mesenchymal stem cell medium | ScienCell | 7501 | Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503) |
| Microplate reader SPECTRO star NANO | BMG Labtech | BMG LABTECH software | |
| PBS | Promocell | C-40232 | Without Ca2+ / Mg2+ |
| Trypan Blue Stain | NanoEnTek | EBT-001 | |
| Trypsin / EDTA | Promocell | C-41020 | Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature |
| 96-well plate Nunclon Delta Surface | Thermoscientific | 167008 |
Riferimenti
- Regier, M. C., Alarid, E. T., Beebe, D. J. Progress towards understanding heterotypic interactions in multi-culture models of breast cancer. Integrative Biology. 8 (6), 684-692 (2016).
- Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions. Journal of Visualized Experiments. (143), e58825 (2019).
- Lin, J., et al. Long non-coding RNA UBE2CP3 enhances HCC cell secretion of VEGFA and promotes angiogenesis by activating ERK1/2/HIF-1α/VEGFA signalling in hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 113 (2018).
- Soares, N. L., et al. Carbon monoxide modulation of microglia-neuron communication: Anti-neuroinflammatory and neurotrophic role. Molecular Neurobiology. 59 (2), 872-889 (2022).
- Al Halawani, A., Abdulkhalek, L., Mithieux, S. M., Weiss, A. S. Tropoelastin promotes the formation of dense, interconnected endothelial networks. Biomolecules. 11 (9), 1318 (2021).
- Mercatali, L., et al. Development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).
- Orona, N. S., Astort, F., Maglione, G. A., Yakisich, J. S., Tasat, D. R. Direct and indirect effect of air particles exposure induce Nrf2-dependent cardiomyocyte cellular response in vitro. Cardiovascular Toxicology. 19 (6), 575-587 (2019).
- Colin-Pierre, C., et al. The glypican-1/HGF/C-met and glypican-1/VEGF/VEGFR2 ternary complexes regulate hair follicle angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 781172 (2021).
- Toubal, A., et al. The NC1 domain of type XIX collagen inhibits melanoma cell migration. European Journal of Dermatology. 20 (6), 712-718 (2010).
- Wu, A. -. L., et al. Role of growth factors and internal limiting membrane constituents in müller cell migration. Experimental Eye Research. 202, 108352 (2021).
- Oudart, J. -. B., et al. Plasmin releases the anti-tumor peptide from the NC1 domain of collagen XIX. Oncotarget. 6 (6), 3656-3668 (2015).
- Martinotti, S., Ranzato, E. Scratch wound healing assay. Methods in Molecular Biology. 2109, 225-229 (2020).
- Cattin, S., Ramont, L., Rüegg, C. Characterization and in vivo validation of a three-dimensional multi-cellular culture model to study heterotypic interactions in colorectal cancer cell growth, invasion and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 97 (2018).
- Ma, Y. N., et al. Three-dimensional spheroid culture of adipose stromal vascular cells for studying adipogenesis in beef cattle. Animal. 12 (10), 2123-2129 (2018).
