Et innovativt 3D-printet skær designet til at muliggøre enkle 2D- og 3D-cellekulturer

Summary

I dette papir præsenteres en nydesignet 3D-printet indsats som en model for co-kultur og valideres gennem undersøgelsen af den parakrin intercellulære kommunikation mellem endotelceller og keratinocytter.

Abstract

De klassiske analyser af indirekte kommunikation mellem forskellige celletyper nødvendiggør brug af konditionerede medier. Desuden forbliver produktionen af konditionerede medier tidskrævende og langt fra fysiologiske og patologiske tilstande. Selv om nogle få modeller af co-kultur er kommercielt tilgængelige, forbliver de begrænset til specifikke assays og er for det meste for to typer celler.

Her anvendes 3D-printede skær, der er kompatible med adskillige funktionelle assays. Indsatsen tillader adskillelse af en brønd i en 6-brøndplade i fire rum. En bred vifte af kombinationer kan indstilles. Desuden er vinduer designet i hver væg i rummene, så potentiel intercellulær kommunikation mellem hvert rum er mulig i kulturmediet på en volumenafhængig måde. For eksempel kan parakrin intercellulær kommunikation studeres mellem fire celletyper i monolag, i 3D (sfæroider) eller ved at kombinere begge. Derudover kan en blanding af forskellige celletyper podes i samme rum i 2D- eller 3D-format (organoider). Fraværet af en bund i de 3D-printede skær tillader de sædvanlige dyrkningsforhold på pladen, mulig belægning på pladen, der indeholder indsatsen, og direkte visualisering ved optisk mikroskopi. De mange rum giver mulighed for at indsamle forskellige celletyper uafhængigt eller i hvert rum anvende forskellige reagenser til RNA- eller proteinekstraktion. I denne undersøgelse gives en detaljeret metode til at bruge det nye 3D-printede skær som et samkultursystem. For at demonstrere flere kapaciteter i denne fleksible og enkle model blev tidligere offentliggjorte funktionelle assays af cellekommunikation udført i de nye 3D-printede indsatser og blev demonstreret at være reproducerbare. De 3D-printede indsatser og den konventionelle cellekultur ved hjælp af konditionerede medier førte til lignende resultater. Afslutningsvis er den 3D-printede indsats en simpel enhed, der kan tilpasses adskillige modeller af cokulturer med klæbende celletyper.

Introduction

In vivo kommunikerer celler med hinanden enten direkte (cellekontakt) eller indirekte (ved udskillelse af molekyler). For at studere cellekommunikation kan der udvikles forskellige samkulturmodeller, såsom direkte samkultur (de forskellige celletyper er i direkte interaktion i samme brønd) og opdelt samkultur (de forskellige celletyper er i indirekte interaktion i forskellige rum i et kultursystem)¹. Desuden kan konditionerede medier anvendes til samkultursystemer, hvor den indirekte interaktion muliggøres af udskillede molekyler indeholdt i det konditionerede medie af en effektorcelletype, der overføres til en respondercelletype¹.

I tilfælde af parakrin cellekommunikationsundersøgelser giver indirekte samkultursystemer modeller, der stærkt afspejler celleinteraktioner in vivo. Indirekte samkultursystemer er blevet udviklet og kommercialiseret, hvilket muliggør etablering af indirekte samkulturmodeller ^2,3. Desværre giver de fleste indirekte samkultursystemer kun to rum. Andre indirekte samkultursystemer giver flere rum, men de er mindre skalerbare sammenlignet med det system, der er rapporteret i dette manuskript. Nogle af dem tillader ikke en klassisk visualisering under et mikroskop, og de præsenterer ofte specifikke applikationsmetoder. I flere undersøgelser undersøges den parakrinkommunikation mellem forskellige celletyper ved hjælp af den konditionerede mediemodel 4,5,6,7. Dette er en lettere måde at undersøge sammenlignet med indirekte samkultursystemer, fordi det ikke kræver, at der fastlægges specifikke metoder eller materialer¹. På den anden side er forberedelsen af konditionerede medier tidskrævende og giver kun information om envejs cellesignalering (effektor til responder)¹.

I dette papir foreslås en ny, enkel måde at undersøge cellekommunikation på. Ved at tillade kombinationen af flere celletyper i direkte eller indirekte interaktion og i 2D- eller 3D-formater giver de trykte skær adskillige fordele ved let at oprette samkulturmodeller. Den 3D-printede indsats er tilpasset til at blive placeret i brøndene på 6-brøndsplader og er cirkulær og tillader adskillelse af brønden i fire rum (to store rum og to små rum; Figur 1A). De 3D-printede skær er kendetegnet ved fraværet af en bund. Således er cellerne i direkte kontakt med pladen, hvorpå indsatsen er placeret. Derudover kan hvert rum belægges uafhængigt af de andre. Desuden kan celleadfærden let følges under optiske mikroskoper. Tilstedeværelsen af kommunikationsvinduer i hver væg af indsatsen tillader tilsætning på det optimale tidspunkt af et fælles medium til at udføre forskellige eksperimenter med samkultur. Talrige kombinationer af co-kultur kan udføres for at studere direkte og / eller indirekte kommunikation mellem flere celletyper. For eksempel kan der designes en model af indirekte samkultur mellem fire forskellige celletyper i monolag og/eller i 3D (sfæroider). En kombination af direkte og indirekte samkulturmodeller kan også udføres ved at blande forskellige celletyper i samme rum. Effekten af komplekse strukturer (organoider, vævseksplantat osv.) på forskellige celletyper kunne være et andet eksempel på modeller, der kan laves. Desuden er de 3D-printede indsatser kompatible med cellebiologiske funktionelle assays (proliferation, migration, pseudorørdannelse, differentiering osv.) og med biokemiske tests (ekstraktion af DNA, RNA, protein, lipider osv.). Endelig giver de 3D-printede skær en bred vifte af eksperimentelle skemaer af samkulturmodeller med mulighed for at kombinere samtidigt forskellige assays i det samme eksperiment i de forskellige rum.

Nogle kapaciteter af de 3D-printede skær præsenteres for at validere dem som en hurtig og brugervenlig samkulturmodel. I sammenligning med et tidligere publiceret studie af parakrin cellekommunikation demonstreres de 3D-printede inserters evne til at være en værdifuld samkulturmodel. For at vurdere dette punkt blev reguleringen af endotelcelleproliferation og migration af keratinocytter sammenlignet mellem det 3D-printede indsatssystem og det klassiske system ved hjælp af konditionerede medier. De 3D-printede skær giver mulighed for hurtigt at opnå lignende resultater sammenlignet med det konventionelle system ved hjælp af konditionerede medier. Faktisk giver de 3D-printede indsatser en robust model til at studere celleinteraktioner i begge retninger uden behov for at producere konditionerede medier og med mulighed for parallelt at udføre sprednings- og migrationsassays i samme eksperiment.

Afslutningsvis foreslås i dette papir en ny og klar til brug model til undersøgelse af cellekommunikation. De 3D-printede indsatser er kompatible med alle klæbende celletyper og giver mulighed for at udføre adskillige kombinationer af samkultur, der sigter mod at være tættere på in vivo-forhold .

Protocol

BEMÆRK: 3D-indsatserne (figur 1A) er kommercielt indkøbt og udskrives ved hjælp af en fotopolymerharpiks, der er biokompatibel med cellekultur og autoklavering (se materialetabellen). I dette afsnit beskrives en detaljeret protokol til etablering af samkulturmodellen ved hjælp af inserts (se figur 1B). Der gives også nogle eksempler på applikationer. 1. Placering af den steriliserede indsats i 6-brøndplad…

Representative Results

I dette arbejde blev der beskrevet et optimeret samkultursystem for at opnå robuste, pålidelige og signifikante data, der kan sammenlignes med klassiske metoder ved brug af konditionerede medier. De 3D-printede skær efterligner in vivo-mikromiljøforholdene for forskellige celletyper i interaktion ved at overvinde vanskelighederne og den tidskrævende produktion af konditionerede medier opstrøms i eksperimenterne. En tidligere offentliggjort undersøgelse er blevet regennemført for at analysere de indirekte…

Discussion

Indirekte cellekommunikation undersøges almindeligvis ved hjælp af konditionerede medier eller co-kultursystemenheder. Konditioneret medieforberedelse er tidskrævende opstrøms i forsøgene, og denne metode er begrænset til ensidige effektanalyser. Den tidligere undersøgelse af Colin-Pierre et al.⁸ ved hjælp af konditionerede medier blev udført på den indirekte cellekommunikation mellem to celletyper (HDMEC’er og KORS). Dataene fra denne tidligere undersøgelse viste effekten af K…

Materials

Autoclave	Getinge	APHP	Solid cycle, 121 °C for 20 min
Biomed Clear	Formlabs	RS-F2-BMCL-01	Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France)
Cell culture detergents	Tounett	A18590/0116
Cell Proliferation Reagent WST-1	Roche	11,64,48,07,001
Counting slide	NanoEnTek	EVE-050
Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm	Ibidi	80206	two-migration chambers device.
Endothelial cell medium	ScienCell	1001	Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503).
EVE Automated cell counter	NanoEnTek	NESCT-EVE-001E
EVOS XL Core	Fisher Scientific	AMEX1200	10x of magnification
Food silicon reagent and catalyst kit	Artificina	RTV 3428 A and B	(10:1)
FORM 3B printer	Formlabs	PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC	Impression performed by 3D-Morphoz company
Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC)	ScienCell	2000
Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS )	ScienCell	2420
Macro Wound Healing Tool Software	ImageJ		Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays)
Mesenchymal stem cell medium	ScienCell	7501	Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503)
Microplate reader SPECTRO star NANO	BMG Labtech		BMG LABTECH software
PBS	Promocell	C-40232	Without Ca2+ / Mg2+
Trypan Blue Stain	NanoEnTek	EBT-001
Trypsin / EDTA	Promocell	C-41020	Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature
96-well plate Nunclon Delta Surface	Thermoscientific	167008