Un innovativo inserto stampato in 3D progettato per consentire colture cellulari 2D e 3D semplici
Summary
In questo articolo, un inserto stampato in 3D di nuova concezione viene presentato come modello di co-coltura e convalidato attraverso lo studio della comunicazione intercellulare paracrina tra cellule endoteliali e cheratinociti.
Abstract
Le analisi classiche della comunicazione indiretta tra diversi tipi di cellule richiedono l’uso di mezzi condizionati. Inoltre, la produzione di terreni condizionati rimane dispendiosa in termini di tempo e lontana da condizioni fisiologiche e patologiche. Sebbene alcuni modelli di co-coltura siano disponibili in commercio, rimangono limitati a saggi specifici e sono per lo più per due tipi di cellule.
In questo caso, vengono utilizzati inserti stampati in 3D compatibili con numerosi saggi funzionali. L’inserto consente la separazione di un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti in quattro scomparti. È possibile impostare un’ampia gamma di combinazioni. Inoltre, le finestre sono progettate in ogni parete dei compartimenti in modo che la potenziale comunicazione intercellulare tra ogni compartimento sia possibile nel terreno di coltura in modo dipendente dal volume. Ad esempio, la comunicazione intercellulare paracrina può essere studiata tra quattro tipi di cellule in monostrato, in 3D (sferoidi) o combinando entrambi. Inoltre, un mix di diversi tipi di cellule può essere seminato nello stesso compartimento in formato 2D o 3D (organoidi). L’assenza di un fondo negli inserti stampati in 3D consente le consuete condizioni di coltura sulla piastra, l’eventuale rivestimento sulla piastra contenente l’inserto e la visualizzazione diretta mediante microscopia ottica. I compartimenti multipli offrono la possibilità di raccogliere diversi tipi di cellule in modo indipendente o di utilizzare, in ogni compartimento, diversi reagenti per l’estrazione di RNA o proteine. In questo studio, viene fornita una metodologia dettagliata per utilizzare il nuovo inserto stampato in 3D come sistema di co-coltura. Per dimostrare diverse capacità di questo modello flessibile e semplice, i saggi funzionali di comunicazione cellulare precedentemente pubblicati sono stati eseguiti nei nuovi inserti stampati in 3D e si sono dimostrati riproducibili. Gli inserti stampati in 3D e la coltura cellulare convenzionale utilizzando terreni condizionati hanno portato a risultati simili. In conclusione, l’inserto stampato in 3D è un dispositivo semplice che può essere adattato a numerosi modelli di co-colture con tipi di cellule aderenti.
Introduction
In vivo, le cellule comunicano tra loro direttamente (contatto cellulare) o indirettamente (secrezione di molecole). Per studiare la comunicazione cellulare, possono essere sviluppati diversi modelli di co-coltura, come la co-coltura diretta (i diversi tipi di cellule sono in interazione diretta nello stesso pozzetto) e la co-coltura compartimentata (i diversi tipi di cellule sono in interazione indiretta in diversi compartimenti di un sistema di coltura)1. Inoltre, i terreni condizionati possono essere utilizzati per i sistemi di co-coltura, in cui l’interazione indiretta è resa possibile dalle molecole secrete contenute nel terreno condizionato di un tipo di cellula effettrice che viene trasferita a una cellula responder di tipo1.
Nel caso di studi di comunicazione cellulare paracrina, i sistemi di co-coltura indiretta forniscono modelli che riflettono fortemente le interazioni cellulari in vivo. Sono stati sviluppati e commercializzati sistemi di co-coltura indiretta, che consentono la creazione di modelli di co-coltura indiretta 2,3. Sfortunatamente, la maggior parte dei sistemi di co-coltura indiretta fornisce solo due compartimenti. Altri sistemi di co-coltura indiretta forniscono compartimenti multipli, ma sono meno scalabili rispetto al sistema riportato nel presente manoscritto. Alcuni di essi non consentono una visualizzazione classica al microscopio e spesso presentano metodi di applicazione specifici. In diversi studi, la comunicazione paracrina tra diversi tipi di cellule è stata sondata dal modello di terreno condizionato 4,5,6,7. Si tratta di un metodo di indagine più semplice rispetto ai sistemi di co-coltura indiretta, in quanto non richiede l’utilizzodi metodi o materiali specifici per l’accertamento 1. D’altra parte, la preparazione di terreni condizionati richiede molto tempo e fornisce informazioni solo sulla segnalazione cellulare unidirezionale (da effettore a responder)1.
In questo articolo, viene proposto un nuovo e semplice modo di studiare la comunicazione cellulare. Consentendo la combinazione di diversi tipi di cellule in interazione diretta o indiretta e in formato 2D o 3D, gli inserti stampati presentano numerosi vantaggi per la facile creazione di modelli di co-coltura. Adattato per essere posizionato nei pozzetti delle piastre a 6 pozzetti, l’inserto stampato in 3D è circolare e consente la separazione del pozzetto in quattro scomparti (due grandi scomparti e due piccoli scomparti; Figura 1A). Gli inserti stampati in 3D sono caratterizzati dall’assenza di fondo. In questo modo, le celle sono a diretto contatto con la piastra su cui è posizionato l’inserto. Inoltre, ogni scomparto può essere rivestito indipendentemente dagli altri. Inoltre, il comportamento cellulare può essere facilmente seguito al microscopio ottico. La presenza di finestre di comunicazione in ogni parete dell’inserto permette l’aggiunta, al momento ottimale, di un medium comune per eseguire diversi esperimenti di co-coltura. Numerose combinazioni di co-coltura possono essere eseguite per studiare la comunicazione diretta e/o indiretta tra diversi tipi di cellule. Ad esempio, è possibile progettare un modello di co-coltura indiretta tra quattro diversi tipi cellulari in monostrato e/o in 3D (sferoidi). Una combinazione di modelli di co-coltura diretta e indiretta può anche essere eseguita mescolando diversi tipi di cellule nello stesso compartimento. L’effetto di strutture complesse (organoidi, espianto di tessuti, ecc.) su diversi tipi di cellule potrebbe essere un altro esempio di modelli che possono essere realizzati. Inoltre, gli inserti stampati in 3D sono compatibili con i saggi funzionali di biologia cellulare (proliferazione, migrazione, formazione di pseudotubi, differenziamento, ecc.) e con i test biochimici (estrazione di DNA, RNA, proteine, lipidi, ecc.). Infine, gli inserti stampati in 3D forniscono un’ampia gamma di schemi sperimentali di modelli di co-coltura con la possibilità di combinare contemporaneamente diversi saggi nello stesso esperimento nei diversi compartimenti.
Vengono presentate alcune capacità degli inserti stampati in 3D per convalidarli come modello di co-coltura rapido e facile da usare. Rispetto a uno studio precedentemente pubblicato condotto sulla comunicazione delle cellule paracrine, viene dimostrata la capacità degli inserti stampati in 3D di essere un prezioso modello di co-coltura. Per valutare questo punto, la regolazione della proliferazione e della migrazione delle cellule endoteliali da parte dei cheratinociti è stata confrontata tra il sistema di inserti stampato in 3D e il sistema classico utilizzando terreni condizionati. Gli inserti stampati in 3D consentono di ottenere rapidamente risultati simili rispetto al sistema convenzionale che utilizza supporti condizionati. Infatti, gli inserti stampati in 3D forniscono un modello robusto per studiare le interazioni cellulari in entrambe le direzioni senza la necessità di produrre terreni condizionati e con la possibilità di eseguire in parallelo i saggi di proliferazione e migrazione nello stesso esperimento.
Per concludere, in questo articolo, viene proposto un nuovo modello pronto all’uso per studiare la comunicazione cellulare. Compatibili con tutti i tipi di cellule aderenti, gli inserti stampati in 3D consentono di eseguire numerose combinazioni di co-coltura che mirano ad essere più vicine alle condizioni in vivo .
Protocol
Representative Results
Discussion
La comunicazione cellulare indiretta viene comunemente studiata utilizzando terreni condizionati o dispositivi di sistemi di co-coltura. La preparazione dei terreni condizionati richiede molto tempo a monte degli esperimenti e questo metodo è limitato alle analisi degli effetti unilaterali. Il precedente studio di Colin-Pierre et al.8 utilizzando terreni condizionati sono stati condotti sulla comunicazione cellulare indiretta tra due tipi di cellule (HDMEC e KORS). I dati di questo studi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato realizzato in collaborazione con BASF Beauty Care Solutions. Charlie Colin-Pierre è un borsista di dottorato finanziato da BASF / CNRS.
Ringraziamo il Sig. Mehdi Sellami per l’ideazione degli inserti stampati in 3D.
Materials
| Autoclave | Getinge | APHP | Solid cycle, 121 °C for 20 min |
| Biomed Clear | Formlabs | RS-F2-BMCL-01 | Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France) |
| Cell culture detergents | Tounett | A18590/0116 | |
| Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche | 11,64,48,07,001 | |
| Counting slide | NanoEnTek | EVE-050 | |
| Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm | Ibidi | 80206 | two-migration chambers device. |
| Endothelial cell medium | ScienCell | 1001 | Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503). |
| EVE Automated cell counter | NanoEnTek | NESCT-EVE-001E | |
| EVOS XL Core | Fisher Scientific | AMEX1200 | 10x of magnification |
| Food silicon reagent and catalyst kit | Artificina | RTV 3428 A and B | (10:1) |
| FORM 3B printer | Formlabs | PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC | Impression performed by 3D-Morphoz company |
| Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC) | ScienCell | 2000 | |
| Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS ) | ScienCell | 2420 | |
| Macro Wound Healing Tool Software | ImageJ | Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays) | |
| Mesenchymal stem cell medium | ScienCell | 7501 | Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503) |
| Microplate reader SPECTRO star NANO | BMG Labtech | BMG LABTECH software | |
| PBS | Promocell | C-40232 | Without Ca2+ / Mg2+ |
| Trypan Blue Stain | NanoEnTek | EBT-001 | |
| Trypsin / EDTA | Promocell | C-41020 | Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature |
| 96-well plate Nunclon Delta Surface | Thermoscientific | 167008 |
Riferimenti
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