簡単な2Dおよび3D細胞培養を可能にするように設計された革新的な3Dプリントインサート
Summary
この論文では、新しく設計された3Dプリントインサートを共培養のモデルとして提示し、内皮細胞とケラチノサイト間のパラクリン細胞間コミュニケーションの研究を通じて検証します。
Abstract
異なる細胞タイプ間の間接的なコミュニケーションの古典的な分析では、馴化培地を使用する必要があります。さらに、馴化培地の製造は依然として時間がかかり、生理学的および病理学的状態からはほど遠い。共培養のいくつかのモデルが市販されていますが、それらは特定のアッセイに限定されたままであり、主に2種類の細胞用です。
ここでは、多数の機能アッセイに適合する3Dプリントインサートが使用されています。インサートにより、6ウェルプレートの1ウェルを4つのコンパートメントに分離できます。幅広い組み合わせを設定できます。さらに、コンパートメントの各壁に窓が設計されているため、各コンパートメント間の潜在的な細胞間コミュニケーションが培地内で体積依存的に可能です。例えば、パラクリンの細胞間コミュニケーションは、単層、3D(スフェロイド)、または両方を組み合わせることによって、4つの細胞タイプ間で研究することができます。さらに、異なる細胞タイプのミックスを2Dまたは3D(オルガノイド)フォーマットで同じコンパートメントに播種することができます。3Dプリントされたインサートに底がないため、プレート上の通常の培養条件、インサートを含むプレートへのコーティング、および光学顕微鏡による直接可視化が可能になります。複数のコンパートメントにより、異なる細胞タイプを個別に収集したり、各コンパートメントでRNAまたはタンパク質抽出に異なる試薬を使用したりすることができます。この研究では、新しい3Dプリントインサートを共培養システムとして使用するための詳細な方法論を提供します。この柔軟でシンプルなモデルのいくつかの能力を実証するために、以前に公開された細胞コミュニケーションの機能アッセイが新しい3Dプリントインサートで実行され、再現性があることが実証されました。3Dプリントされたインサートと、馴化培地を使用した従来の細胞培養でも、同様の結果が得られました。結論として、3Dプリントインサートは、接着細胞タイプとの共培養の多数のモデルに適応できるシンプルなデバイスです。
Introduction
生体内では、細胞は直接的(細胞接触)または間接的(分子の分泌による)のいずれかで互いに通信します。細胞コミュニケーションを研究するために、直接共培養(異なる細胞タイプが同じウェル内で直接相互作用する)や区画化共培養(異なる細胞タイプが培養システムの異なるコンパートメントで間接的に相互作用する)1など、さまざまな共培養モデルを開発できます。さらに、馴化培地は共培養系に使用でき、エフェクター細胞タイプの馴化培地に含まれる分泌分子がレスポンダー細胞タイプ1に移されることによって間接的な相互作用が可能になります。
パラクリン細胞コミュニケーション研究の場合、間接共培養システムは、in vivoでの細胞相互作用を強く反映するモデルを提供します。間接共培養システムが開発・実用化され、間接共培養モデルの確立が可能となった2,3。残念ながら、ほとんどの間接共培養システムは2つのコンパートメントしか提供しません。他の間接共培養システムは複数のコンパートメントを提供しますが、本稿で報告されているシステムと比較して拡張性が低くなります。それらのいくつかは顕微鏡下での古典的な視覚化を可能にしません、そしてそれらはしばしば特定の適用方法を提示します。いくつかの研究では、異なる細胞型間のパラクリン通信が馴化培地モデル4,5,6,7によって調査されています。これは、特定の方法や材料を確立する必要がないため、間接的な共培養システムと比較して調査が容易です1。一方、馴化培地の調製には時間がかかり、一方向の細胞シグナル伝達(エフェクターからレスポンダー)に関する情報のみを提供します1。
この論文では、細胞コミュニケーションを調査する新しい簡単な方法を提案します。直接的または間接的な相互作用および2Dまたは3Dフォーマットで複数の細胞タイプを組み合わせることができるプリントインサートは、共培養モデルを簡単に設定するための多くの利点を提供します。6ウェルプレートのウェルに配置するのに適した3Dプリントインサートは円形で、ウェルを4つのコンパートメント(2つの大きなコンパートメントと2つの小さなコンパートメント; 図1A)。3Dプリントされたインサートは、底部がないことを特徴としています。したがって、セルはインサートが配置されているプレートと直接接触しています。さらに、各コンパートメントは他のコンパートメントとは独立してコーティングすることができます。さらに、細胞の挙動は光学顕微鏡で簡単に追跡できます。インサートの各壁に通信窓が存在するため、最適なタイミングで共通の培地を追加して、共培養のさまざまな実験を行うことができます。共培養の多数の組み合わせを実行して、複数の細胞タイプ間の直接的および/または間接的なコミュニケーションを研究することができます。例えば、単層および/または3D(スフェロイド)の4つの異なる細胞タイプ間の間接共培養のモデルを設計できます。直接的および間接的な共培養モデルの組み合わせは、同じコンパートメント内で異なる細胞型を混合することによっても行うことができる。異なる細胞型に対する複雑な構造(オルガノイド、組織外植片など)の影響は、作成可能なモデルの別の例である可能性があります。さらに、3Dプリントされたインサートは、細胞生物学の機能アッセイ(増殖、遊走、偽管形成、分化など)および生化学試験(DNA、RNA、タンパク質、脂質などの抽出)と互換性があります。最後に、3Dプリントされたインサートは、共培養モデルの幅広い実験スキームを提供し、異なるコンパートメントでの同じ実験で同時に異なるアッセイを組み合わせる可能性があります。
3Dプリントされたインサートのいくつかの能力は、迅速で使いやすい共培養モデルとして検証するために提示されます。パラクリン細胞のコミュニケーションに関して実施された以前に発表された研究と比較して、3Dプリントされたインサートが貴重な共培養モデルになる能力が実証されています。この点を評価するために、ケラチノサイトによる内皮細胞の増殖と遊走の調節を、3Dプリントされたインサートシステムと馴化培地を使用した古典的なシステムとの間で比較しました。3Dプリントされたインサートは、馴化培地を使用する従来のシステムと比較して、同様の結果を迅速に得ることができます。実際、3Dプリントされたインサートは、馴化培地を製造する必要がなく、同じ実験で増殖アッセイと遊走アッセイを並行して実行する可能性なしに、両方向の細胞相互作用を研究するための堅牢なモデルを提供します。
結論として、この論文では、細胞コミュニケーションを研究するための新しいすぐに使用できるモデルが提案されています。すべての接着細胞タイプと互換性があり、3Dプリントされたインサートは、 in vivo 条件に近づくことを目的とした共培養の多数の組み合わせを実行できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
間接的な細胞コミュニケーションは、一般的に馴化培地または共培養システムデバイスを使用して調査されます。馴化培地の調製は実験の上流に時間がかかり、この方法は片側効果分析に限定されています。Colin-Pierreらによる以前の研究 。馴 化培地を用いて8、2つの細胞型(HDMECsおよびKORS)間の間接的な細胞間通信を行った。この先行研究のデータは、HDMEC増殖に対す?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この調査は、BASFビューティーケアソリューションズと共同で行われました。チャーリー・コリン・ピエールは、BASF/CNRSが資金提供する博士号フェローです。
3Dプリントされたインサートの構想について、Mehdi Sellami氏に感謝します。
Materials
| Autoclave | Getinge | APHP | Solid cycle, 121 °C for 20 min |
| Biomed Clear | Formlabs | RS-F2-BMCL-01 | Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France) |
| Cell culture detergents | Tounett | A18590/0116 | |
| Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche | 11,64,48,07,001 | |
| Counting slide | NanoEnTek | EVE-050 | |
| Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm | Ibidi | 80206 | two-migration chambers device. |
| Endothelial cell medium | ScienCell | 1001 | Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503). |
| EVE Automated cell counter | NanoEnTek | NESCT-EVE-001E | |
| EVOS XL Core | Fisher Scientific | AMEX1200 | 10x of magnification |
| Food silicon reagent and catalyst kit | Artificina | RTV 3428 A and B | (10:1) |
| FORM 3B printer | Formlabs | PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC | Impression performed by 3D-Morphoz company |
| Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC) | ScienCell | 2000 | |
| Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS ) | ScienCell | 2420 | |
| Macro Wound Healing Tool Software | ImageJ | Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays) | |
| Mesenchymal stem cell medium | ScienCell | 7501 | Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503) |
| Microplate reader SPECTRO star NANO | BMG Labtech | BMG LABTECH software | |
| PBS | Promocell | C-40232 | Without Ca2+ / Mg2+ |
| Trypan Blue Stain | NanoEnTek | EBT-001 | |
| Trypsin / EDTA | Promocell | C-41020 | Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature |
| 96-well plate Nunclon Delta Surface | Thermoscientific | 167008 |
Riferimenti
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