En innovativ 3D-printet innsats designet for å muliggjøre enkle 2D- og 3D-cellekulturer

Summary

I denne artikkelen presenteres en nydesignet 3D-printet innsats som en modell for samkultur og valideres gjennom studiet av den parakrine intercellulære kommunikasjonen mellom endotelceller og keratinocytter.

Abstract

De klassiske analysene av indirekte kommunikasjon mellom ulike celletyper nødvendiggjør bruk av betingede medier. Videre forblir produksjonen av betingede medier tidkrevende og langt fra fysiologiske og patologiske forhold. Selv om noen få modeller av samkultur er kommersielt tilgjengelige, forblir de begrenset til spesifikke analyser og er for det meste for to typer celler.

Her brukes 3D-printede innsatser som er kompatible med mange funksjonelle analyser. Innsatsen tillater separasjon av en brønn på en 6-brønnsplate i fire rom. Et bredt spekter av kombinasjoner kan stilles inn. Videre er vinduene utformet i hver vegg i rommene slik at potensiell intercellulær kommunikasjon mellom hvert rom er mulig i kulturmediet på en volumavhengig måte. For eksempel kan parakrin intercellulær kommunikasjon studeres mellom fire celletyper i monolag, i 3D (sfæroider), eller ved å kombinere begge. I tillegg kan en blanding av forskjellige celletyper sås i samme rom i 2D- eller 3D-format (organoider). Fraværet av en bunn i de 3D-printede innsatsene tillater de vanlige kulturforholdene på platen, mulig belegg på platen som inneholder innsatsen, og direkte visualisering ved optisk mikroskopi. De mange rommene gir muligheten til å samle forskjellige celletyper uavhengig eller å bruke, i hvert rom, forskjellige reagenser for RNA eller proteinekstraksjon. I denne studien er det gitt en detaljert metodikk for å bruke den nye 3D-printede innsatsen som et samkultursystem. For å demonstrere flere kapasiteter i denne fleksible og enkle modellen, ble tidligere publiserte funksjonelle analyser av cellekommunikasjon utført i de nye 3D-printede innsatsene og ble vist å være reproduserbare. De 3D-printede innsatsene og den konvensjonelle cellekulturen ved bruk av betingede medier førte til lignende resultater. Avslutningsvis er den 3D-printede innsatsen en enkel enhet som kan tilpasses mange modeller av samkulturer med adherente celletyper.

Introduction

In vivo kommuniserer celler med hverandre enten direkte (cellekontakt) eller indirekte (ved sekresjon av molekyler). For å studere cellekommunikasjon kan forskjellige kokulturmodeller utvikles, for eksempel direkte samkultur (de forskjellige celletypene er i direkte interaksjon i samme brønn) og kompartmentalisert samkultur (de forskjellige celletypene er i indirekte interaksjon i forskjellige rom i et kultursystem)¹. Videre kan betingede medier brukes til samkultursystemer, hvor den indirekte interaksjonen aktiveres ved at utskilte molekyler inneholdt i det kondisjonerte mediet av en effektorcelletype overføres til en respondercelletype¹.

Når det gjelder parakrine cellekommunikasjonsstudier, gir indirekte kokultursystemer modeller som sterkt reflekterer celleinteraksjoner in vivo. Indirekte samkultursystemer er utviklet og kommersialisert, noe som gjør det mulig å etablere indirekte samkulturmodeller ^2,3. Dessverre gir de fleste indirekte samkultursystemer bare to avdelinger. Andre indirekte samkultursystemer gir flere avdelinger, men de er mindre skalerbare sammenlignet med systemet rapportert i dette manuskriptet. Noen av dem tillater ikke en klassisk visualisering under et mikroskop, og de presenterer ofte spesifikke applikasjonsmetoder. I flere studier blir den parakrine kommunikasjonen mellom forskjellige celletyper undersøkt av den betingede mediemodellen 4,5,6,7. Dette er en enklere måte å undersøke på sammenlignet med indirekte samkultursystemer fordi det ikke er nødvendig^{å etablere bestemte} metoder eller materialer 1. På den annen side er fremstilling av betingede medier tidkrevende og gir bare informasjon om enveis cellesignalering (effektor til responder)¹.

I dette papiret foreslås en ny, enkel måte å undersøke cellekommunikasjon på. Ved å tillate kombinasjonen av flere celletyper i direkte eller indirekte interaksjon og i 2D- eller 3D-formater, gir de trykte innsatsene mange fordeler for enkelt å sette opp samkulturmodeller. Den 3D-printede innsatsen er tilpasset for å plasseres i brønnene på 6-brønnsplater, og er sirkulær og tillater separasjon av brønnen i fire rom (to store rom og to små rom; Figur 1A). De 3D-printede innsatsene er preget av fravær av bunn. Dermed er cellene i direkte kontakt med platen som innsatsen er plassert på. I tillegg kan hvert rom belegges uavhengig av de andre. Videre kan celleoppførselen lett følges under optiske mikroskoper. Tilstedeværelsen av kommunikasjonsvinduer i hver vegg av innsatsen gjør det mulig å legge til, på det optimale tidspunktet, av et felles medium for å utføre forskjellige eksperimenter med samkultur. Tallrike kombinasjoner av samkultur kan utføres for å studere direkte og / eller indirekte kommunikasjon mellom flere celletyper. For eksempel kan en modell av indirekte samkultur mellom fire forskjellige celletyper i monolag og/eller i 3D (sfæroider) designes. En kombinasjon av direkte og indirekte kokulturmodeller kan også utføres ved å blande forskjellige celletyper i samme rom. Effekten av komplekse strukturer (organoider, vevseksplant, etc.) på forskjellige celletyper kan være et annet eksempel på modeller som kan gjøres. Videre er de 3D-printede innsatsene kompatible med cellebiologiske funksjonelle analyser (spredning, migrasjon, pseudorørdannelse, differensiering, etc.) og med biokjemiske tester (ekstraksjon av DNA, RNA, protein, lipider, etc.). Til slutt gir de 3D-printede innsatsene et bredt spekter av eksperimentelle ordninger av samkulturmodeller med mulighet til å kombinere samtidig forskjellige analyser i samme eksperiment i de forskjellige rommene.

Noen kapasiteter til de 3D-printede innsatsene presenteres for å validere dem som en rask og brukervennlig samkulturmodell. Sammenlignet med en tidligere publisert studie utført på parakrin cellekommunikasjon, er evnen til de 3D-printede innsatsene til å være en verdifull samkulturmodell demonstrert. For å vurdere dette punktet ble reguleringen av endotelcelleproliferasjon og migrasjon av keratinocytter sammenlignet mellom det 3D-printede innsatssystemet og det klassiske systemet ved bruk av betingede medier. De 3D-printede innsatsene gjør det mulig å oppnå lignende resultater raskt sammenlignet med det konvensjonelle systemet ved bruk av betingede medier. Faktisk gir de 3D-printede innsatsene en robust modell for å studere celleinteraksjoner i begge retninger uten at det er nødvendig å produsere betingede medier og med muligheten til å utføre parallelt sprednings- og migrasjonsanalysene i samme eksperiment.

For å konkludere, i dette papiret, foreslås en ny og klar til bruk modell for å studere cellekommunikasjon. De 3D-printede innsatsene er kompatible med alle adherente celletyper, og gjør det mulig å utføre en rekke kombinasjoner av samkultur som tar sikte på å være nærmere in vivo-forhold .

Protocol

MERK: 3D-innsatsene (figur 1A) er kommersielt anskaffet og skrives ut ved hjelp av en fotopolymerharpiks som er biokompatibel med cellekultur og autoklavering (se materialtabellen). I dette avsnittet beskrives en detaljert protokoll for å etablere samkulturmodellen ved innstikk (se figur 1B). Noen eksempler på applikasjoner er også gitt. 1. Plassering av den steriliserte innsatsen i 6-brønnsplatene<…

Representative Results

I dette arbeidet ble det beskrevet et optimalisert samkultursystem for å oppnå robuste, pålitelige og signifikante data som kan sammenlignes med klassiske metoder ved bruk av betingede medier. De 3D-printede innsatsene etterligner in vivo mikromiljøforholdene til forskjellige celletyper i samspill ved å overvinne vanskelighetene og den tidkrevende produksjonen av betingede medier oppstrøms i forsøkene. En tidligere publisert studie har blitt reutført for å analysere de indirekte interaksjonene mellom to…

Discussion

Indirekte cellekommunikasjon blir ofte undersøkt ved hjelp av betingede medier eller samkultursystemenheter. Betinget mediepreparering er tidkrevende oppstrøms i forsøkene, og denne metoden er begrenset til ensidige effektanalyser. Den forrige studien av Colin-Pierre et al.⁸ Bruk av betingede medier ble utført på indirekte cellekommunikasjon mellom to celletyper (HDMEC og KORS). Dataene fra denne tidligere studien viste effekten av KORS betingede medier på HDMEC-spredning og effekte…

Materials

Autoclave	Getinge	APHP	Solid cycle, 121 °C for 20 min
Biomed Clear	Formlabs	RS-F2-BMCL-01	Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France)
Cell culture detergents	Tounett	A18590/0116
Cell Proliferation Reagent WST-1	Roche	11,64,48,07,001
Counting slide	NanoEnTek	EVE-050
Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm	Ibidi	80206	two-migration chambers device.
Endothelial cell medium	ScienCell	1001	Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503).
EVE Automated cell counter	NanoEnTek	NESCT-EVE-001E
EVOS XL Core	Fisher Scientific	AMEX1200	10x of magnification
Food silicon reagent and catalyst kit	Artificina	RTV 3428 A and B	(10:1)
FORM 3B printer	Formlabs	PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC	Impression performed by 3D-Morphoz company
Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC)	ScienCell	2000
Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS )	ScienCell	2420
Macro Wound Healing Tool Software	ImageJ		Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays)
Mesenchymal stem cell medium	ScienCell	7501	Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503)
Microplate reader SPECTRO star NANO	BMG Labtech		BMG LABTECH software
PBS	Promocell	C-40232	Without Ca2+ / Mg2+
Trypan Blue Stain	NanoEnTek	EBT-001
Trypsin / EDTA	Promocell	C-41020	Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature
96-well plate Nunclon Delta Surface	Thermoscientific	167008