Um inserto inovador impresso em 3D projetado para permitir culturas de células 2D e 3D diretas

Summary

Neste artigo, um novo inserto impresso em 3D é apresentado como um modelo de co-cultura e validado através do estudo da comunicação intercelular parácrina entre células endoteliais e queratinócitos.

Abstract

As análises clássicas da comunicação indireta entre diferentes tipos celulares requerem o uso de meios condicionados. Além disso, a produção de meios condicionados permanece demorada e distante de condições fisiológicas e patológicas. Embora alguns modelos de co-cultura estejam comercialmente disponíveis, eles permanecem restritos a ensaios específicos e são principalmente para dois tipos de células.

Aqui, são usados insertos impressos em 3D que são compatíveis com inúmeros ensaios funcionais. A pastilha permite a separação de um poço de uma placa de 6 poços em quatro compartimentos. Uma ampla gama de combinações pode ser definida. Além disso, janelas são projetadas em cada parede dos compartimentos para que a comunicação intercelular potencial entre cada compartimento seja possível no meio de cultura de forma dependente do volume. Por exemplo, a comunicação intercelular parácrina pode ser estudada entre quatro tipos celulares em monocamada, em 3D (esferoides) ou combinando ambos. Além disso, uma mistura de diferentes tipos de células pode ser semeada no mesmo compartimento em formato 2D ou 3D (organoides). A ausência de fundo nos insertos impressos em 3D permite as condições usuais de cultura na placa, possível revestimento na placa que contém o inserto e visualização direta por microscopia óptica. Os múltiplos compartimentos oferecem a possibilidade de coletar diferentes tipos celulares de forma independente ou de utilizar, em cada compartimento, diferentes reagentes para extração de RNA ou proteínas. Neste estudo, uma metodologia detalhada é fornecida para usar o novo inserto impresso em 3D como um sistema de co-cultura. Para demonstrar várias capacidades deste modelo flexível e simples, ensaios funcionais de comunicação celular previamente publicados foram realizados nos novos insertos impressos em 3D e demonstraram ser reprodutíveis. As pastilhas impressas em 3D e a cultura celular convencional em meio condicionado levaram a resultados semelhantes. Em conclusão, o inserto impresso em 3D é um dispositivo simples que pode ser adaptado a inúmeros modelos de co-culturas com tipos celulares aderentes.

Introduction

In vivo, as células se comunicam entre si diretamente (contato celular) ou indiretamente (por secreção de moléculas). Para estudar a comunicação celular, diferentes modelos de co-cultura podem ser desenvolvidos, como o co-cultivo direto (os diferentes tipos celulares estão em interação direta no mesmo poço) e o co-cultivo compartimentado (os diferentes tipos celulares estão em interação indireta em diferentes compartimentos de um sistema de cultura)¹. Além disso, meios condicionados podem ser usados para sistemas de co-cultura, onde a interação indireta é possibilitada por moléculas secretadas contidas no meio condicionado de um tipo de célula efetora sendo transferida para uma célula respondedora tipo¹.

No caso de estudos de comunicação celular parácrina, sistemas de co-cultura indireta fornecem modelos que refletem fortemente as interações celulares in vivo. Sistemas de cocultura indireta têm sido desenvolvidos e comercializados, permitindo o estabelecimento de modelos de cocultura indireta ^2,3. Infelizmente, a maioria dos sistemas de co-cultura indireta fornece apenas dois compartimentos. Outros sistemas de co-cultura indireta fornecem múltiplos compartimentos, mas são menos escaláveis em comparação com o sistema relatado no presente manuscrito. Alguns deles não permitem uma visualização clássica ao microscópio e, muitas vezes, apresentam métodos específicos de aplicação. Em vários estudos, a comunicação parácrina entre diferentes tipos celulares é investigada pelo modelo de meios^{condicionados} 4,5,6,7. Esta é uma maneira mais fácil de investigação em comparação com sistemas de co-cultura indireta, pois não requer métodos ou materiais específicos para serem estabelecidos¹. Por outro lado, a preparação de meios condicionados é demorada e fornece informações apenas sobre a sinalização celular unidirecional (efetor para respondedor)¹.

Neste artigo, uma nova e simples forma de investigar a comunicação celular é proposta. Permitindo a combinação de vários tipos celulares em interação direta ou indireta e em formatos 2D ou 3D, os insertos impressos apresentam inúmeras vantagens para a fácil montagem de modelos de co-cultura. Adaptado para ser colocado nos poços de placas de 6 poços, o inserto impresso em 3D é circular e permite a separação do poço em quatro compartimentos (dois grandes compartimentos e dois pequenos compartimentos; Figura 1A). As pastilhas impressas em 3D são caracterizadas pela ausência de um fundo. Assim, as células ficam em contato direto com a placa na qual a pastilha é colocada. Além disso, cada compartimento pode ser revestido independentemente dos outros. Além disso, o comportamento celular pode ser facilmente acompanhado em microscópios ópticos. A presença de janelas de comunicação em cada parede da pastilha permite a adição, no momento ideal, de um meio comum para realizar diferentes experimentos de co-cultura. Inúmeras combinações de co-cultura podem ser realizadas para estudar a comunicação direta e/ou indireta entre vários tipos celulares. Por exemplo, um modelo de co-cultura indireta entre quatro tipos diferentes de células em monocamada e/ou em 3D (esferoides) pode ser projetado. Uma combinação de modelos de co-cultura direta e indireta também pode ser realizada misturando diferentes tipos celulares no mesmo compartimento. O efeito de estruturas complexas (organoides, explantes teciduais, etc.) sobre diferentes tipos celulares poderia ser outro exemplo de modelos que podem ser feitos. Além disso, as inserções impressas em 3D são compatíveis com ensaios funcionais de biologia celular (proliferação, migração, formação de pseudotubos, diferenciação, etc.) e com testes bioquímicos (extração de DNA, RNA, proteínas, lipídios, etc.). Finalmente, os insertos impressos em 3D fornecem uma ampla gama de esquemas experimentais de modelos de co-cultura com a possibilidade de combinar simultaneamente diferentes ensaios no mesmo experimento nos diferentes compartimentos.

Algumas capacidades dos encartes impressos em 3D são apresentadas para validá-los como um modelo de co-cultura rápido e fácil de usar. Em comparação com um estudo publicado anteriormente sobre comunicação celular parácrina, a capacidade das pastilhas impressas em 3D de serem um valioso modelo de co-cultura é demonstrada. Para avaliar esse ponto, a regulação da proliferação e migração de células endoteliais pelos queratinócitos foi comparada entre o sistema de inserção impresso em 3D e o sistema clássico usando meios condicionados. Os insertos impressos em 3D permitem a obtenção de resultados semelhantes rapidamente em relação ao sistema convencional que utiliza meios condicionados. De fato, as pastilhas impressas em 3D fornecem um modelo robusto para estudar interações celulares em ambas as direções sem a necessidade de produzir meios condicionados e com a possibilidade de realizar em paralelo os ensaios de proliferação e migração em um mesmo experimento.

Para concluir, neste artigo, um novo modelo pronto para uso para estudar a comunicação celular é proposto. Compatíveis com todos os tipos celulares aderentes, as pastilhas impressas em 3D permitem realizar inúmeras combinações de co-cultura que visam estar mais próximas das condições in vivo .

Protocol

NOTA: Os insertos 3D (Figura 1A) são adquiridos comercialmente e impressos usando uma resina fotopolimérica que é biocompatível com cultura de células e autoclavagem (consulte a Tabela de Materiais). Nesta seção, um protocolo detalhado para estabelecer o modelo de co-cultura por inserções é descrito (ver Figura 1B). Alguns exemplos de aplicações também são fornecidos. 1. Colocação da pastilha est…

Representative Results

No presente trabalho, um sistema de co-cultivo otimizado foi descrito para obter dados robustos, confiáveis e significativos comparáveis aos métodos clássicos através do uso de meios condicionados. As inserções impressas em 3D mimetizam as condições do microambiente in vivo de diferentes tipos celulares em interação, superando as dificuldades e a demorada produção de meios condicionados a montante nos experimentos. Um estudo publicado anteriormente foi reconduzido para analisar as interações indir…

Discussion

A comunicação celular indireta é comumente investigada usando meios condicionados ou dispositivos de sistemas de co-cultura. A preparação de meios condicionados é demorada a montante nos experimentos, e esse método é restrito a análises de efeitos unilaterais. O estudo anterior de Colin-Pierre et al.⁸ utilizando meios condicionados foi realizada a comunicação celular indireta entre dois tipos celulares (HDMECs e KORS). Os dados deste estudo anterior demonstraram o efeito do mei…

Materials

Autoclave	Getinge	APHP	Solid cycle, 121 °C for 20 min
Biomed Clear	Formlabs	RS-F2-BMCL-01	Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France)
Cell culture detergents	Tounett	A18590/0116
Cell Proliferation Reagent WST-1	Roche	11,64,48,07,001
Counting slide	NanoEnTek	EVE-050
Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm	Ibidi	80206	two-migration chambers device.
Endothelial cell medium	ScienCell	1001	Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503).
EVE Automated cell counter	NanoEnTek	NESCT-EVE-001E
EVOS XL Core	Fisher Scientific	AMEX1200	10x of magnification
Food silicon reagent and catalyst kit	Artificina	RTV 3428 A and B	(10:1)
FORM 3B printer	Formlabs	PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC	Impression performed by 3D-Morphoz company
Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC)	ScienCell	2000
Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS )	ScienCell	2420
Macro Wound Healing Tool Software	ImageJ		Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays)
Mesenchymal stem cell medium	ScienCell	7501	Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503)
Microplate reader SPECTRO star NANO	BMG Labtech		BMG LABTECH software
PBS	Promocell	C-40232	Without Ca2+ / Mg2+
Trypan Blue Stain	NanoEnTek	EBT-001
Trypsin / EDTA	Promocell	C-41020	Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature
96-well plate Nunclon Delta Surface	Thermoscientific	167008