Étude des interactions entre les enzymes modifiant l’histone et les facteurs de transcription in vivo par transfert d’énergie par résonance de fluorescence

Summary

Le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) est une technique d’imagerie permettant de détecter les interactions protéiques dans les cellules vivantes. Ici, un protocole FRET est présenté pour étudier l’association des enzymes modifiant les histones avec des facteurs de transcription qui les recrutent vers les promoteurs cibles de la régulation épigénétique de l’expression génique dans les tissus végétaux.

Abstract

La régulation épigénétique de l’expression génique est généralement affectée par les enzymes modifiant les histones (HME) qui génèrent des marques d’histones hétérochromatiques ou euchromatiques pour la répression transcriptionnelle ou l’activation, respectivement. Les HME sont recrutés pour leur chromatine cible par des facteurs de transcription (TF). Ainsi, la détection et la caractérisation des interactions directes entre les HME et les TF sont essentielles pour mieux comprendre leur fonction et leur spécificité. Ces études seraient plus pertinentes sur le plan biologique si elles étaient réalisées in vivo dans des tissus vivants. Ici, un protocole est décrit pour visualiser les interactions dans les feuilles des plantes entre une histone déubiquitinase végétale et un facteur de transcription de la plante en utilisant le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET), ce qui permet la détection de complexes entre des molécules de protéines qui se trouvent à moins de <10 nm les unes des autres. Deux variantes de la technique FRET sont présentées : SE-FRET (émission sensibilisée) et AB-FRET (blanchiment accepteur), dans lesquelles l’énergie est transférée non radiativement du donneur à l’accepteur ou émise radiativement par le donneur lors du photoblanchiment de l’accepteur. Les approches SE-FRET et AB-FRET peuvent être facilement adaptées pour découvrir d’autres interactions entre d’autres protéines in planta.

Introduction

Les histone déubiquitinases végétales jouent un rôle important dans le contrôle de l’expression génique par modification post-traductionnelle des histones, notamment en effaçant leurs marques de monoubiquitylation¹. Jusqu’à présent, OTLD1 est l’une des rares histone déubiquitinases végétales caractérisées au niveau moléculaire chez Arabidopsis ^2,3. OTLD1 élimine les groupes monoubiquitine des molécules d’histones H2B, favorisant ainsi l’élimination ou l’ajout d’acétylation euchromatique et de modifications de méthylation des histones H3 dans le gène cible chromatine ^4,5. De plus, OTLD1 interagit avec une autre enzyme modifiant la chromatine, l’histone lysine déméthylase KDM1C, pour affecter la suppression transcriptionnelle des gènes cibles ^6,7.

La plupart des enzymes modifiant les histones n’ont pas de capacités de liaison à l’ADN et ne peuvent donc pas reconnaître directement leurs gènes cibles. Une possibilité est qu’ils coopèrent avec les protéines du facteur de transcription liant l’ADN qui lient ces enzymes et les dirigent vers leurs cibles de chromatine. Plus précisément, chez les plantes, plusieurs enzymes importantes modifiant les histones (c.-à-d. les histone méthyltransférases^8,9, les histone acétyltransférases 10, les histone déméthylases 11 et les complexes répressifs Polycomb^12,13,14) sont connues pour être recrutées par des facteurs de transcription. Conformément à cette idée, récemment, un mécanisme possible pour le recrutement d’OTLD1 chez les promoteurs cibles a été proposé, basé sur des interactions protéine-protéine spécifiques d’OTLD1 avec un facteur de transcription LSH10¹⁵.

LSH10 appartient à une famille de protéines végétales ALOG (Arabidopsis LSH1 et Oryza G1) qui fonctionnent comme régulateurs centraux du développement 16,17,18,19,20,21,22. Le fait que les membres de la famille des protéines ALOG contiennent des motifs de liaison à l’ADN²³ et présentent les capacités de régulation transcriptionnelle 22, de localisation nucléaire¹⁹ et d’homodimérisation²⁴ renforce l’idée que ces protéines, y compris LSH10, peuvent agir comme facteurs de transcription spécifiques lors de la régulation épigénétique de la transcription. L’une des principales techniques expérimentales utilisées pour caractériser l’interaction LSH10-OTLD1 in vivo est le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET)¹⁵.

FRET est une technique d’imagerie permettant de détecter directement les interactions à courte distance entre les protéines à <10 nm les unes des autres²⁵ à l’intérieur des cellules vivantes. Il existe deux variantes principales de l’approche FRET²⁶: l’émission sensibilisée (SE-FRET) (figure 1A) et le blanchiment accepteur (AB-FRET) (figure 1B). Dans le SE-FRET, les protéines en interaction – dont l’une est marquée avec un fluorochrome donneur (par exemple, protéine fluorescente verte, GFP) et l’autre avec un fluorochrome accepteur (par exemple, protéine fluorescente rouge monomère, mRFP^27,28) – transfèrent non radiativement l’énergie de l’état excité du donneur à l’accepteur. Parce qu’aucun photon n’est émis pendant ce transfert, un signal fluorescent est produit qui a un spectre d’émission radiatif similaire à celui de l’accepteur. Dans l’AB-FRET, les interactions protéiques sont détectées et quantifiées en fonction de l’émission radiative élevée du donneur lorsque l’accepteur est inactivé en permanence par photoblanchiment et est donc incapable de recevoir l’énergie non radiative transférée du donneur (Figure 1). Il est important de noter que l’emplacement subcellulaire de la fluorescence FRET indique la localisation des protéines en interaction dans la cellule.

La capacité de déployer FRET dans les tissus vivants et de déterminer la localisation subcellulaire des protéines en interaction simultanément avec la détection de cette interaction en soi, fait de FRET la technique de choix pour les études et la caractérisation initiale des interactions protéine-protéine in vivo. Une méthodologie d’imagerie par fluorescence in vivo comparable, la complémentarité par fluorescence bimoléculaire (BiFC)29,30,31,32, est une bonne approche alternative, bien que, contrairement au FRET, le BiFC puisse produire des faux positifs en raison de l’assemblage spontané des rapporteurs BiFC ^{autofluorescents 33,} et la quantification de ses données est moins précise.

Cet article partage l’expérience réussie dans la mise en œuvre des techniques SE-FRET et AB-FRET et présente un protocole pour leur déploiement afin d’étudier les interactions entre OTLD1 et LSH10 dans les cellules végétales.

Protocol

Nicotiana benthamiana, la souche EHA105 d’Agrobacterium tumefaciens ou GV3101 ont été utilisées pour la présente étude. 1. Construction de vecteurs FRET Sélectionnez des étiquettes fluorescentes pour la paire donneur/accepteur FRET.Utilisez l’EGFP de pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (voir le tableau des matériaux) pour générer le vecteur donneur. <li…

Representative Results

La figure 2 illustre les résultats typiques d’une expérience SE-FRET, dans laquelle les noyaux cellulaires ont été enregistrés simultanément dans trois canaux (c.-à-d. GFP du donneur, accepteur mRFP et SE-FRET). Ces données ont été utilisées pour générer des images de l’efficacité SE-FRET codées dans une pseudo-échelle de couleurs. Sur cette échelle, le passage du bleu au rouge correspond à une augmentation de l’efficacité du FRET, une mesure de la proximité protéi…

Discussion

Ce protocole FRET est simple et facile à reproduire ; Il nécessite également un investissement minimal en fournitures et utilise un équipement standard pour de nombreux laboratoires modernes. Plus précisément, cinq caractéristiques techniques principales distinguent la polyvalence de cette procédure. Tout d’abord, les constructions FRET sont générées à l’aide d’une recombinaison spécifique au site, une approche de clonage facile à utiliser, produisant des résultats précis et permettant de gagner du …

Materials

Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone)	Sigma-Aldrich	#D134406-1G
Bacto Agar	BD Biosciences	#214010
Bacto trypton	BD Biosciences	#211705
Bacto yeast extract	BD Biosciences	#212750
Confocal laser scanning microscope (CLSM)	Zeiss	LSM900	Any CLSM with similar capabilities is suitable
EHA105	VWR	104013-310	We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
Gateway BP Clonase II	Invitrogen	#11789100
Gateway LR Clonase II	Invitrogen	#11791020
GV3101	VWR	104013-296	We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
ImageJ			https://imagej.nih.gov/ij/download.html
MES	Sigma-Aldrich	#69889-10G
MgCl2	Sigma-Aldrich	#63068-250G
NaCl	Sigma-Aldrich	#S5886-500G
Nicotiana benthamiana seeds	Herbalistics Pty	RA4 or LAB	We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection
pDONR207	Invitrogen	#12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1	N/A		Refs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1	N/A		Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1	N/A		Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct
Rifampicin	Sigma-Aldrich	#R7382-5G
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	#S4014-5G
Syringes without needles	BD	309659
Zen software for CLSM imaging	Zeiss	ZEN 3.0 version	The software should be compatible with the CLSM used