Den kliniske mikrofluidiske chip er en vigtig biomedicinsk analyseteknik, der forenkler forbehandling af kliniske patienters blodprøver og immunfluorescerende pletter cirkulerende tumorceller (CTC’er) in situ på chippen, hvilket muliggør hurtig påvisning og identifikation af en enkelt CTC.
Cirkulerende tumorceller (CTC’er) er signifikante i kræftprognose, diagnose og kræftbehandling. CTC-optælling er afgørende for at bestemme patientsygdom, da CTC’er er sjældne og heterogene. CTC’er løsnes fra den primære tumor, kommer ind i blodcirkulationssystemet og vokser potentielt på fjerne steder og metastaserer således tumoren. Da CTC’er bærer lignende oplysninger til den primære tumor, kan CTC-isolering og efterfølgende karakterisering være kritisk i overvågning og diagnosticering af kræft. Optælling, affinitetsmodifikation og klinisk immunfluorescensfarvning af sjældne CTC’er er kraftfulde metoder til CTC-isolering, fordi de giver de nødvendige elementer høj følsomhed. Mikrofluidiske chips tilbyder en flydende biopsimetode, der er fri for smerter for patienterne. I dette arbejde præsenterer vi en liste over protokoller for kliniske mikrofluidiske chips, en alsidig CTC-isoleringsplatform, der indeholder et sæt funktioner og tjenester, der kræves til CTC-separation, analyse og tidlig diagnose, hvilket letter biomolekylær analyse og kræftbehandling. Programmet omfatter sjældne tumorcelletællinger, klinisk patientblodforbehandling, som omfatter lyse af røde blodlegemer og isolering og genkendelse af CTC’er in situ på mikrofluidiske chips. Programmet tillader præcis optælling af tumorceller eller CTC’er. Derudover indeholder programmet et værktøj, der inkorporerer CTC-isolering med alsidige mikrofluidiske chips og immunofluorescensidentifikation in situ på chipsene efterfulgt af biomolekylær analyse.
Cirkulerende tumorceller (CTC’er) er signifikante i kræftprognose, diagnose og kræftbehandling. CTC-optælling er afgørende, da CTC’er er sjældne og heterogene. Optælling, affinitetsmodifikation og klinisk immunfluorescensfarvning af sjældne CTC’er er kraftfulde teknikker til CTC-isolering, fordi de tilbyder de nødvendige elementer med høj følsomhed1. Sjældent antal tumorceller blandet med normalt blod efterligner nøje ægte patientblod, da 2-3 ml ægte patientblod kun indeholder 1-10 CTC’er. For at løse et kritisk eksperimentelt problem, i stedet for at bruge et stort antal tumorceller indført i PBS eller blandet med normalt blod, giver brugen af sjældent antal tumorceller os et lavt antal blodlegemer, hvilket er tættere på virkeligheden, når vi udfører et eksperiment.
Kræft er den største dødsårsag i verden2. CTC’er er tumorceller, der udskilles fra den oprindelige tumor, der cirkulerer i blodet og lymfecirkulationssystemerne3. Når CTC’er flytter til et nyt overlevende miljø, vokser de som en anden tumor. Dette kaldes metastase og er ansvarlig for 90% af dødsfaldene hos kræftpatienter4. CTC’er er afgørende for prognose, tidlig diagnose og for at forstå kræftmekanismerne. CTC’er er imidlertid ekstremt sjældne og heterogene i patientblod 5,6.
Mikrofluidiske chips tilbyder en flydende biopsi, der ikke invaderer tumoren. De har fordelen ved at være bærbare, lave omkostninger og have en cellematchet skala. Isoleringen af CTC’er med mikrofluidiske chips klassificeres hovedsageligt i to typer: affinitetsbaseret, som er afhængig af antigen-antistofbinding 7,8,9 og er den originale og mest anvendte metode til CTC-isolering; og fysisk baserede chips, der udnytter størrelses- og deformerbarhedsforskelle mellem tumorceller og blodlegemer 10,11,12,13,14,15, er etiketfri og er nemme at betjene. Fordelen ved mikrofluidiske chips i forhold til alternative teknikker er, at den fysisk baserede tilgang til mikrofiltre med stor ellipse fanger CTC’er med høj fangsteffektivitet. Årsagen til dette er, at ellipsemikrostolper er organiseret i slanke tunneler af linjelinjehuller. Linjelinjehullerne adskiller sig fra de traditionelle punktpunktgab dannet af mikrostolper såsom rombemikroposter. Bølgechipbaseret indfangning af CTC’er kombinerer både fysisk egenskabsbaseret og affinitetsbaseret isolation. Bølgechipbaseret optagelse involverer 30 bølgeformede arrays med antistoffet af anti-EpCAM belagt på cirkulære mikroposter. CTC’erne fanges af de små huller, og de store huller bruges til at fremskynde strømningshastigheden. De ubesvarede CTC’er skal passere de små huller i det næste array og fanges af den affinitetsbaserede isolation, der er integreret i chip16.
Målet med protokollen er at demonstrere tællingen af sjældne antal tumorceller og den kliniske analyse af CTC’er med mikrofluidiske chips. Protokollen beskriver CTC-isolationstrinnene, hvordan man opnår et lavt antal tumorceller, den kliniske fysiske adskillelse af små ellipsefiltre, big-ellipsefiltre og trapezformede filtre, affinitetsmodifikation og berigelse17.
Prognosen og tidlig diagnosticering af kræft har en signifikant effekt på kræftbehandling1. CTC-isolering med mikrofluidiske chips tilbyder en flydende biopsi uden invasion. CTC’er er imidlertid ekstremt sjældne og heterogene i blodet1, hvilket gør det udfordrende at isolere CTC’er. CTC’er har lignende egenskaber som de oprindelige tumorkilder, hvorfra de stammer. Således spiller CTC’er en afgørende rolle i kræftmetastase1.
<p class="jov…The authors have nothing to disclose.
Dette forskningsarbejde blev støttet af Anhui Natural Science Foundation of China (1908085MF197, 1908085QB66), National Natural Science Foundation of China (21904003), det videnskabelige forskningsprojekt fra Tianjin Education Commission (2018KJ154), det provinsielle naturvidenskabelige forskningsprogram for videregående uddannelsesinstitutioner i Anhui-provinsen (KJ2020A0239) og Shanghai Key Laboratory of Multidimensional Information Processing, East China Key Laboratory of Multidimensional Information Forarbejdning, East China Normal University (MIP20221).
Calcein AM | BIOTIUM | 80011 | |
calibrated microcapillary pipettes | Sigma- Aldrich | P0799 | |
CD45-PE | BD Biosciences | 560975 | |
CK-FITC | BD Biosciences | 347653 | cytokeratin monoclonal antibody |
DMEM | HyClone | SH30081.05 | |
fetal bovine serum (FBS) | GIBCO,USA | 26140 | |
Hoechst 33342 | Molecular Probes, Solarbio Corp., China | C0031 | |
penicillin-streptomycin | Ying Reliable biotechnology, China | ||
Red blood cells lysis (RBCL) | Solarbio, Beijing | R1010 |