Plateforme de puces microfluidiques cliniques pour l’isolement de cellules tumorales circulantes polyvalentes
Summary
La puce microfluidique clinique est une technique d’analyse biomédicale importante qui simplifie le prétraitement des échantillons de sang cliniques des patients et colore immunofluorement les cellules tumorales circulantes (CTC) in situ sur la puce, permettant la détection et l’identification rapides d’un seul CTC.
Abstract
Les cellules tumorales circulantes (CTC) sont importantes dans le pronostic du cancer, le diagnostic et le traitement anticancéreux. Le dénombrement des CTC est essentiel pour déterminer la maladie du patient, car les CTC sont rares et hétérogènes. Les CTC sont détachés de la tumeur primaire, pénètrent dans le système de circulation sanguine et se développent potentiellement à des sites distants, métastasant ainsi la tumeur. Étant donné que les CTC portent des informations similaires à celles de la tumeur primaire, l’isolement des CTC et la caractérisation ultérieure peuvent être essentiels dans la surveillance et le diagnostic du cancer. Le dénombrement, la modification de l’affinité et la coloration par immunofluorescence clinique des CTC rares sont des méthodes puissantes pour l’isolement des CTC, car elles fournissent les éléments nécessaires avec une sensibilité élevée. Les puces microfluidiques offrent une méthode de biopsie liquide exempte de toute douleur pour les patients. Dans ce travail, nous présentons une liste de protocoles pour les puces microfluidiques cliniques, une plate-forme polyvalente d’isolation CTC, qui intègre un ensemble de fonctionnalités et de services nécessaires à la séparation, à l’analyse et au diagnostic précoce des CTC, facilitant ainsi l’analyse biomoléculaire et le traitement du cancer. Le programme comprend le comptage des cellules tumorales rares, le prétraitement clinique du sang des patients, qui comprend la lyse des globules rouges, ainsi que l’isolement et la reconnaissance des CTC in situ sur des puces microfluidiques. Le programme permet le dénombrement précis des cellules tumorales ou CTC. De plus, le programme comprend un outil qui intègre l’isolation CTC avec des puces microfluidiques polyvalentes et l’identification par immunofluorescence in situ sur les puces, suivie d’une analyse biomoléculaire.
Introduction
Les cellules tumorales circulantes (CTC) sont importantes dans le pronostic du cancer, le diagnostic et le traitement anticancéreux. Le dénombrement des CTC est essentiel car les CTC sont rares et hétérogènes. Le dénombrement, la modification de l’affinité et la coloration clinique par immunofluorescence des CTC rares sont des techniques puissantes pour l’isolement des CTC car elles offrent les éléments nécessaires avec une sensibilité élevée1. Un nombre rare de cellules tumorales mélangées à du sang normal imite étroitement le sang réel des patients, car 2 à 3 ml de sang réel de patient ne contiennent que 1 à 10 CTC. Pour résoudre un problème expérimental critique, au lieu d’utiliser un grand nombre de cellules tumorales introduites dans le PBS ou mélangées avec du sang normal, l’utilisation d’un nombre rare de cellules tumorales nous fournit un faible nombre de cellules sanguines, ce qui est plus proche de la réalité lors de la réalisation d’une expérience.
Le cancer est la première cause de décès dans le monde2. Les CTC sont des cellules tumorales excrétées de la tumeur d’origine qui circulent dans les systèmes de circulation sanguine et lymphatique3. Lorsque les CTC se déplacent vers un nouvel environnement de survie, ils se développent comme une deuxième tumeur. C’est ce qu’on appelle la métastase et elle est responsable de 90% des décès chez les patients cancéreux4. Les CTC sont essentiels pour le pronostic, le diagnostic précoce et la compréhension des mécanismes du cancer. Cependant, les CTC sont extrêmement rares et hétérogènes dans le sang des patients 5,6.
Les puces microfluidiques offrent une biopsie liquide qui n’envahit pas la tumeur. Ils ont l’avantage d’être portables, peu coûteux et d’avoir une balance adaptée aux cellules. L’isolement des CTC à l’aide de puces microfluidiques est classé principalement en deux types: basé sur l’affinité, qui repose sur la liaison antigène-anticorps 7,8,9 et est la méthode originale et la plus largement utilisée d’isolement CTC; et les puces physiques, qui utilisent les différences de taille et de déformabilité entre les cellules tumorales et les cellules sanguines 10,11,12,13,14,15, sont sans marquage et faciles à utiliser. L’avantage des puces microfluidiques par rapport aux techniques alternatives est que l’approche physique des microfiltres à grosses ellipses capture fermement les CTC avec une efficacité de capture élevée. La raison en est que les micropoteaux d’ellipse sont organisés en minces tunnels d’espaces ligne-ligne. Les écarts de ligne de ligne sont différents des écarts de point de point traditionnels formés par des micropoteaux tels que les micropoteaux de losange. La capture de CTC basée sur des puces à ondes combine à la fois une isolation basée sur les propriétés physiques et une isolation basée sur l’affinité. La capture par puce à ondes implique 30 réseaux en forme d’onde avec l’anticorps anti-EpCAM recouvert de micropoteaux circulaires. Les CTC sont capturés par les petits espaces, et les grands écarts sont utilisés pour accélérer le débit. Les CTC manqués doivent passer les petits espaces dans la matrice suivante et sont capturés par l’isolation basée sur l’affinité intégrée à l’intérieur de la puce16.
L’objectif du protocole est de démontrer le comptage d’un nombre rare de cellules tumorales et l’analyse clinique des CTC avec des puces microfluidiques. Le protocole décrit les étapes d’isolement CTC, comment obtenir un faible nombre de cellules tumorales, la séparation physique clinique des filtres à petites ellipses et des filtres à grandes ellipses et des filtres trapézoïdaux, la modification de l’affinité et l’enrichissement17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le pronostic et le diagnostic précoce du cancer ont un effet significatif sur le traitement du cancer1. L’isolement CTC avec des puces microfluidiques offre une biopsie liquide sans invasion. Cependant, les CTC sont extrêmement rares et hétérogènes dans le sang1, ce qui rend difficile l’isolement des CTC. Les CTC ont des propriétés similaires aux sources tumorales d’origine d’où ils proviennent. Ainsi, les CTC jouent un rôle essentiel dans les métastases c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail de recherche a été soutenu par la Fondation chinoise des sciences naturelles de l’Anhui (1908085MF197, 1908085QB66), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (21904003), le Projet de recherche scientifique de la Commission de l’éducation de Tianjin (2018KJ154), le Programme provincial de recherche en sciences naturelles des établissements d’enseignement supérieur de la province de l’Anhui (KJ2020A0239) et le Shanghai Key Laboratory of Multidimensional Information Processing, East China Key Laboratory of Multidimensional Information Transformation, Université normale de Chine orientale (MIP20221).
Materials
| Calcein AM | BIOTIUM | 80011 | |
| calibrated microcapillary pipettes | Sigma- Aldrich | P0799 | |
| CD45-PE | BD Biosciences | 560975 | |
| CK-FITC | BD Biosciences | 347653 | cytokeratin monoclonal antibody |
| DMEM | HyClone | SH30081.05 | |
| fetal bovine serum (FBS) | GIBCO,USA | 26140 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes, Solarbio Corp., China | C0031 | |
| penicillin-streptomycin | Ying Reliable biotechnology, China | ||
| Red blood cells lysis (RBCL) | Solarbio, Beijing | R1010 |
Riferimenti
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