פלטפורמת שבבים מיקרופלואידית קלינית לבידוד תאי גידול רב-תכליתיים במחזור הדם
Summary
השבב המיקרופלואידי הקליני הוא טכניקת ניתוח ביו-רפואית חשובה המפשטת עיבוד מקדים של דגימות דם קליניות של מטופלים ומכתימה באופן אימונופלואורסצנטי תאי גידול במחזור הדם (CTCs) באתרם על השבב, ומאפשרת זיהוי וזיהוי מהירים של CTC יחיד.
Abstract
תאי גידול במחזור הדם (CTCs) משמעותיים בפרוגנוזה של סרטן, אבחון וטיפול נגד סרטן. ספירת CTC חיונית בקביעת מחלת המטופל מכיוון ש- CTCs הם נדירים והטרוגניים. CTCs מנותקים מהגידול הראשוני, נכנסים למערכת זרימת הדם, ועלולים לגדול באתרים מרוחקים, ובכך לשלוח גרורות לגידול. מכיוון ש- CTCs נושאים מידע דומה לגידול הראשוני, בידוד CTC ואפיון לאחר מכן יכולים להיות קריטיים בניטור ואבחון סרטן. הספירה, שינוי האהדה והצביעה האימונופלואורסצנטית הקלינית של CTCs נדירים הן שיטות רבות עוצמה לבידוד CTC מכיוון שהן מספקות את האלמנטים הדרושים עם רגישות גבוהה. שבבים מיקרופלואידים מציעים שיטת ביופסיה נוזלית ללא כל כאב עבור החולים. בעבודה זו, אנו מציגים רשימה של פרוטוקולים עבור שבבים מיקרופלואידים קליניים, פלטפורמת בידוד CTC רב-תכליתית, המשלבים מערך של פונקציות ושירותים הדרושים להפרדה, ניתוח ואבחון מוקדם של CTC, ובכך מאפשרים ניתוח ביומולקולרי וטיפול בסרטן. התוכנית כוללת ספירת תאי גידול נדירים, עיבוד מקדים קליני של דם המטופל, הכולל ליזה של תאי דם אדומים, ובידוד והכרה של CTCs באתרם על שבבים מיקרופלואידים. התוכנית מאפשרת ספירה מדויקת של תאי גידול או CTCs. בנוסף, התוכנית כוללת כלי המשלב בידוד CTC עם שבבים מיקרופלואידים רב-תכליתיים וזיהוי אימונופלואורסצנטי באתרו על השבבים, ולאחר מכן אנליזה ביומולקולרית.
Introduction
תאי גידול במחזור הדם (CTCs) משמעותיים בפרוגנוזה של סרטן, אבחון וטיפול נגד סרטן. ספירת CTC חיונית מכיוון ש- CTCs הם נדירים והטרוגניים. הספירה, שינוי האהדה והצביעה האימונופלואורסצנטית הקלינית של CTCs נדירים הן טכניקות רבות עוצמה לבידוד CTC מכיוון שהן מציעות את האלמנטים הדרושים עם רגישות גבוהה1. מספר נדיר של תאי גידול מעורבבים עם דם נורמלי מחקה באופן הדוק דם חולה אמיתי מאז 2-3 מ”ל של דם חולה אמיתי מכיל רק 1-10 CTCs. כדי לפתור בעיה ניסיונית קריטית, במקום להשתמש במספר גדול של תאי גידול שהוכנסו ל-PBS או מעורבבים עם דם רגיל, השימוש במספר נדיר של תאי גידול מספק לנו מספר נמוך של תאי דם, שהוא קרוב יותר למציאות בעת ביצוע ניסוי.
סרטן הוא סיבת המוות המובילה בעולם2. CTCs הם תאי גידול שנשפכים מהגידול המקורי ומסתובבים במערכת הדם והלימפה3. כאשר CTCs עוברים לסביבה חדשה הניתנת לשרידות, הם גדלים כגידול שני. זה נקרא גרורות והוא אחראי ל 90% ממקרי המוות בחולי סרטן4. CTCs חיוניים לפרוגנוזה, לאבחון מוקדם ולהבנת מנגנוני הסרטן. עם זאת, CTCs הם נדירים ביותר והטרוגניים בדם המטופל 5,6.
שבבים מיקרופלואידים מציעים ביופסיה נוזלית שאינה פולשת לגידול. יש להם את היתרון של היותם ניידים, בעלות נמוכה ובעלי קנה מידה תואם תאים. הבידוד של CTCs עם שבבים מיקרופלואידים מסווג בעיקר לשני סוגים: מבוסס זיקה, המסתמך על אנטיגן-נוגדנים קושרים 7,8,9 והיא השיטה המקורית והנפוצה ביותר לבידוד CTC; ושבבים פיזיים, המנצלים את הבדלי הגודל והעיוות בין תאי הגידול לתאי הדם 10,11,12,13,14,15, הם נטולי תוויות וקלים לתפעול. היתרון של שבבים מיקרופלואידים על פני טכניקות חלופיות הוא שהגישה המבוססת פיזית של מיקרו-פילטרים בעלי אליפסה גדולה לוכדת היטב CTCs ביעילות לכידה גבוהה. הסיבה לכך היא שמיקרו-עמודי אליפסה מאורגנים במנהרות דקות של רווחי קו. מרווחי הקו שונים מהמרווחים המסורתיים בין נקודות נקודתיות שנוצרו על ידי מיקרו-פוסטים כגון מיקרו-פוסטים של מעוין. לכידה מבוססת שבב גל של CTCs משלבת הן בידוד מבוסס רכוש פיזי והן בידוד מבוסס אהדה. לכידה מבוססת שבב גל כוללת 30 מערכים בצורת גל עם נוגדן של אנטי-EpCAM מצופה על מיקרופוסטים עגולים. ה-CTCs נלכדים על ידי הפערים הקטנים, והפערים הגדולים משמשים להאצת קצב הזרימה. ה-CTCs המוחמצים צריכים לעבור את הפערים הקטנים במערך הבא ונלכדים על ידי בידוד מבוסס זיקה המשולב בתוך השבב16.
מטרת הפרוטוקול היא להדגים ספירה של מספרים נדירים של תאי גידול ואת הניתוח הקליני של CTCs עם שבבים מיקרופלואידים. הפרוטוקול מתאר את שלבי הבידוד של CTC, כיצד להשיג מספר נמוך של תאי גידול, ההפרדה הפיזית הקלינית של מסנני אליפסה קטנים, מסנני אליפסה גדולה ומסנני טרפז, שינוי זיקה והעשרה17.
Protocol
Representative Results
Discussion
לפרוגנוזה ולאבחון מוקדם של סרטן יש השפעה משמעותית על הטיפול בסרטן1. בידוד CTC עם שבבים מיקרופלואידים מציע ביופסיה נוזלית ללא פלישה. עם זאת, CTCs הם נדירים ביותר והטרוגניים בדם1, מה שהופך את זה למאתגר לבודד CTCs. CTCs יש תכונות דומות למקורות הגידול המקוריים שממנו הם מגיעים….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודת מחקר זו נתמכה על ידי קרן Anhui למדעי הטבע של סין (1908085MF197, 1908085QB66), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (21904003), פרויקט המחקר המדעי של ועדת החינוך של טיאנג’ין (2018KJ154), תוכנית המחקר המחוזית למדעי הטבע של מוסדות להשכלה גבוהה במחוז אנחווי (KJ2020A0239), ומעבדת המפתח של שנחאי לעיבוד מידע רב-ממדי, מעבדת המפתח של מזרח סין למידע רב-ממדי עיבוד, אוניברסיטת מזרח סין הרגילה (MIP20221).
Materials
| Calcein AM | BIOTIUM | 80011 | |
| calibrated microcapillary pipettes | Sigma- Aldrich | P0799 | |
| CD45-PE | BD Biosciences | 560975 | |
| CK-FITC | BD Biosciences | 347653 | cytokeratin monoclonal antibody |
| DMEM | HyClone | SH30081.05 | |
| fetal bovine serum (FBS) | GIBCO,USA | 26140 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes, Solarbio Corp., China | C0031 | |
| penicillin-streptomycin | Ying Reliable biotechnology, China | ||
| Red blood cells lysis (RBCL) | Solarbio, Beijing | R1010 |
Riferimenti
- Chen, H., et al. Highly-sensitive capture of circulating tumor cells using micro-ellipse filters. Scientific Reports. 7 (1), 610 (2017).
- . World Health Organization Cancer report Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer (2022)
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nature Reviews Cancer. 8 (5), 329-340 (2008).
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: A question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Sollier, E., et al. Size-selective collection of circulating tumor cells using Vortex technology. Lab on a Chip. 14 (1), 63-77 (2014).
- Stott, S. L., et al. Isolation and characterization of circulating tumor cells from patients with localized and metastatic prostate cancer. Science Translational Medicine. 2 (25), 23 (2010).
- Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).
- Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumor cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Murlidhar, V., et al. A radial flow microfluidic device for ultra-high-throughput affinity-based isolation of circulating tumor cells. Small. 10 (23), 4895-4904 (2014).
- Tan, S. J., Yobas, L., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. Microdevice for the isolation and enumeration of cancer cells from blood. Biomedical Microdevices. 11 (4), 883-892 (2009).
- Preira, P., et al. Passive circulating cell sorting by deformability using a microfluidic gradual filter. Lab on a Chip. 13 (1), 161-170 (2013).
- Yan, S., Zhang, J., Yuan, D., Li, W. Hybrid microfluidics combined with active and passive approaches for continuous cell separation. Electrophoresis. 38 (2), 238-249 (2017).
- Patil, P., Madhuprasad Kumeria, T., Losic, D., Kurkuri, M. Isolation of circulating tumour cells by physical means in a microfluidic device: A review. RSC Advances. 5 (109), 89745-89762 (2015).
- Kumeria, T., et al. Photoswitchable membranes based on peptide-modified nanoporous anodic alumina: Toward smart membranes for on-demand molecular transport. Advanced Materials. 27 (19), 3019-3024 (2015).
- Mahesh, P. B., et al. Recent advances in microfluidic platform for physical and immunological detection and capture of circulating tumor cells. Biosensors. 12 (4), 220 (2022).
- Chen, H., Cao, B., Chen, H., Lin, Y. -. S., Zhang, J. Combination of antibody-coated, physical-based microfluidic chip with wave-shaped arrays for isolating circulating tumor cells. Biomedical Microdevices. 19 (3), 66 (2017).
- Rushton, A. J., Nteliopoulos, G., Shaw, J. A., Coombes, R. C. A review of circulating tumour cell enrichment technologies. Cancers. 13 (5), 970 (2021).
- Chen, H., Zhang, Z. An inertia-deformability hybrid CTC chip: Design, clinical test and numerical study. Journal of Medical Devices. 12 (4), 041004 (2018).
