यह प्रोटोकॉल म्यूरिन मौखिक-एसोफैगल 3 डी ऑर्गेनोइड्स को उत्पन्न करने और चिह्नित करने के लिए प्रमुख चरणों का वर्णन करता है जो रासायनिक कार्सिनोजेनेसिस के माध्यम से प्रेरित सामान्य, प्रीनोप्लास्टिक और स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा घावों का प्रतिनिधित्व करते हैं।
एसोफेजेल स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (ईएससीसी) दुनिया भर में प्रचलित है, जो हर साल सभी एसोफैगल कैंसर के मामलों का 90% हिस्सा है, और सभी मानव स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा में सबसे घातक है। ईएससीसी दीक्षा और विकास के साथ आणविक परिवर्तनों को परिभाषित करने में हालिया प्रगति के बावजूद, रोगी का पूर्वानुमान खराब रहता है। इन आणविक परिवर्तनों का कार्यात्मक एनोटेशन आवश्यक अगला कदम है और ऐसे मॉडल की आवश्यकता होती है जो दोनों ईएससीसी की आणविक विशेषताओं को पकड़ते हैं और कार्यात्मक एनोटेशन के लिए आसानी से और सस्ते में हेरफेर किया जा सकता है। तंबाकू के धुएं के साथ इलाज किए गए चूहे मिमेटिक 4-नाइट्रोक्विनोलिन 1-ऑक्साइड (4एनक्यूओ) अनुमानित रूप से ईएससीसी और एसोफैगल प्रीनोप्लासिया बनाते हैं। ध्यान दें, 4NQO घाव मौखिक गुहा में भी उत्पन्न होते हैं, आमतौर पर जीभ में, साथ ही साथ फोरडोमैक, जो सभी स्तरीकृत स्क्वैमस एपिथेलियम को साझा करते हैं। हालांकि, इन चूहों को कार्यात्मक परिकल्पना परीक्षण के लिए केवल हेरफेर नहीं किया जा सकता है, क्योंकि इसोजेनिक माउस मॉडल उत्पन्न करना समय और संसाधन-गहन है। यहां, हमने मुराइन ईएससीसी या प्रीनियोप्लास्टिक कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए 4एनक्यूओ के साथ इलाज किए गए चूहों से एकल सेल-व्युत्पन्न त्रि-आयामी (3 डी) ऑर्गेनोइड उत्पन्न करके इस सीमा को दूर किया। ये ऑर्गेनोइड ईएससीसी और एसोफेजेल प्रीनोप्लासिया की मुख्य विशेषताओं को पकड़ते हैं, सस्ते में और जल्दी से इसोजेनिक मॉडल बनाने के लिए लाभ उठाया जा सकता है, और सिंजेनिक प्रत्यारोपण प्रयोगों के लिए उपयोग किया जा सकता है। हम प्रदर्शित करते हैं कि सामान्य, प्रीनियोप्लास्टिक और एससीसी मुराइन एसोफैगल ऊतक से 3 डी ऑर्गेनोइड्स कैसे उत्पन्न करें और इन ऑर्गेनोइड्स को बनाए रखें और क्रायोप्रिजर्व करें। इन बहुमुखी ऑर्गेनोइड्स के अनुप्रयोग व्यापक हैं और इसमें आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों का उपयोग और फ्लो साइटोमेट्री या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा आगे के लक्षण वर्णन, सीआरआईएसपीआर प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके आइसोजेनिक ऑर्गेनॉइड लाइनों की पीढ़ी और दवा स्क्रीनिंग या सिंजेनिक प्रत्यारोपण शामिल हैं। हमारा मानना है कि इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शित तकनीकों को व्यापक रूप से अपनाने से ईएससीसी के गंभीर बोझ का मुकाबला करने के लिए इस क्षेत्र में प्रगति में तेजी आएगी।
एसोफेजेल स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (ईएससीसी) मानव स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा का सबसे घातक है, इसके देर से निदान, चिकित्सा प्रतिरोध और मेटास्टेसिस 1,2 के कारण। ईएससीसी स्तरीकृत स्क्वैमस एपिथेलियम से उत्पन्न होता है, जो अन्नप्रणाली की ल्यूमिनल सतह को रेखाबद्ध करता है। स्क्वैमस एपिथेलियम में प्रोलिफेरेटिव बेसल कोशिकाएं और सुप्राबेसल सेल परत के भीतर विभेदित कोशिकाएं शामिल हैं। शारीरिक स्थितियों के तहत, बेसल कोशिकाएं पी 63, सॉक्स 2, और साइटोकेराटिन के 5 और के 14 जैसे मार्करों को व्यक्त करती हैं, जबकि विभेदित कोशिकाएं के 4, के 13 और आईवीएल को व्यक्त करती हैं। बेसल कोशिकाएं स्वयं विषम होती हैं और इसमें के 15 3 और सीडी73 4 जैसे मार्करों द्वारा परिभाषित कथित स्टेम सेल शामिल होते हैं। होमियोस्टैसिस में, बेसल कोशिकाएं सुप्राबेसल सेल परत के भीतर पोस्ट-माइटोटिक टर्मिनल भेदभाव से गुजरती हैं, जबकि विभेदित कोशिकाएं उपकला नवीकरण को पूरा करने के लिए लुमेन में प्रवास और निर्जलीकरण करती हैं। मूल की उनकी कोशिकाओं की याद दिलाते हुए, ईएससीसी स्क्वैमस सेल भेदभाव को अलग-अलग डिग्री तक प्रदर्शित करता है। ईएससीसी अक्सर मल्टीफोकल हिस्टोलॉजिकल अग्रदूत घावों के साथ होता है, जिसे इंट्राएपिथेलियल नियोप्लासिया (आईईएन) या डिस्प्लेसिया के रूप में जाना जाता है, जिसमें एटिपिकल बेसलॉइड कोशिकाएं शामिल होती हैं। उपकला परिवर्तनों के अलावा, ईएससीसी उपउपकला डिब्बे के भीतर ऊतक रीमॉडेलिंग प्रदर्शित करता है, जहां कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट्स (सीएएफ) की सक्रियता और प्रतिरक्षा / भड़काऊ कोशिकाओं की भर्ती ट्यूमर को बढ़ावा देने वाले माइक्रोएन्वायरमेंट को बढ़ावा देने के लिए होती है।
ईएससीसी के रोगजनन में आनुवंशिक परिवर्तन और पर्यावरणीय जोखिम कारकों के संपर्क में आना शामिल है। प्रमुख आनुवंशिक घावों में ट्यूमर सप्रेसर जीन टीपी 53 और सीडीकेएन 2 ए (पी 16 आईएनके 4 ए) की निष्क्रियता और सीसीएनडी 1 (साइक्लिन डी 1) और ईजीएफआर ऑन्कोजीन की सक्रियता शामिल है, जो बिगड़ा हुआ सेल चक्र चेकपॉइंट फ़ंक्शन, असामान्य प्रसार और पर्यावरणीय कार्सिनोजेन्स के संपर्क से संबंधित जीनोटॉक्सिक तनाव के तहत जीवित रहने में समाप्त होता है। दरअसल, आनुवंशिक परिवर्तन व्यवहार और पर्यावरणीय जोखिम कारकों के साथ निकटता से बातचीत करते हैं, आमतौर पर तंबाकू और शराब का उपयोग। तंबाकू के धुएं में एसिटालडिहाइड जैसे मानव कार्सिनोजेन होते हैं, जो शराब का प्रमुख मेटाबोलाइट भी है। एसीटैल्डिहाइड डीएनए जोड़ों और इंटरस्ट्रैंड डीएनए क्रॉसलिंक को प्रेरित करता है, जिससे डीएनए क्षति और डीएनए उत्परिवर्तन और क्रोमोसोमल अस्थिरता का संचय होता है। अत्यधिक माइटोजेनिक उत्तेजनाओं और ऑन्कोजीन सक्रियण से असामान्य प्रसार को देखते हुए, एसोफेजेल उपकला कोशिकाओं के घातक परिवर्तन को जीनोटॉक्सिक तनाव से निपटने के लिए तंत्र द्वारा सुविधाजनक बनाया जाता है, जिसमें एंटीऑक्सिडेंट, ऑटोफैगी और उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी) की सक्रियता शामिल है। दिलचस्प बात यह है कि ये साइटोप्रोटेक्टिव फ़ंक्शन अक्सर ईएससीसी कैंसर स्टेम कोशिकाओं (सीएससी) में सक्रिय होते हैं जो उच्च सीडी 44 (सीडी 44 एच) अभिव्यक्ति की विशेषता रखते हैं और ट्यूमर दीक्षा, आक्रमण, मेटास्टेसिस और चिकित्सा प्रतिरोध 5,6,7 की क्षमताएं होती हैं।
ईएससीसी को सेल कल्चर और कृंतक मॉडल 8,9 में मॉडलिंग किया गया है। पिछले तीन दशकों में, ईएससीसी के मजबूत आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल विकसित किए गए हैं। इनमें सीसीएनडी 1 और ईजीएफआर ट्रांसजेनिक चूहे10,11 और पी 53 और पी 120सीटीएन नॉकआउट चूहे12,13 शामिल हैं। हालांकि, एकल आनुवंशिक परिवर्तन आमतौर पर तेजी से शुरू होने वाले ईएससीसी का परिणाम नहीं होता है। इस चुनौती को एसोफेजेल कार्सिनोजेन्स के उपयोग से दूर किया गया है जो ईएससीसी14 में मानव आनुवंशिक घावों को अच्छी तरह से पुन: उत्पन्न करते हैं। उदाहरण के लिए, 4-नाइट्रोक्विनोलिन-1-ऑक्साइड (4एनक्यूओ) सीसीएनडी 1 ट्रांसजेनिक चूहों15 में ईएससीसी विकास को तेज करता है। हाल के वर्षों में, सेल वंश-ट्रेसेबल माउस मॉडल 3,4 में कथित एसोफेजेल एपिथेलियल स्टेम सेल, पूर्वज कोशिकाओं और उनके संबंधित भाग्य की जांच की गई है। इसके अलावा, इन सेल वंश-ट्रेस करने योग्य चूहों का उपयोग ईएससीसी की उत्पत्ति की कोशिकाओं का पता लगाने के लिए किया गया है और ऐसी कोशिकाएं पारंपरिक हिस्टोलॉजी और ओमिक्स-आधारित आणविक लक्षण वर्णन7 के माध्यम से सीडी 44 एच सीएससी को कैसे जन्म देती हैं।
इन माउस मॉडल से संबंधित एक उभरता हुआ क्षेत्र तीन आयामी (3 डी) ऑर्गेनॉइड सिस्टम में लाइव ईएससीसी और अग्रदूत कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए सेल कल्चर तकनीकों का नया अनुप्रयोग है जिसमें मूल ऊतकों की वास्तुकला को विवो 7,8,9 से पुन: परिभाषित किया जाता है। ये 3 डी ऑर्गेनोइड तेजी से म्यूरिन ऊतकों से पृथक एकल-कोशिका निलंबन से उगाए जाते हैं, जिसमें प्राथमिक और मेटास्टैटिक ट्यूमर (जैसे, लिम्फ नोड, फेफड़े और यकृत घाव) शामिल हैं। कोशिकाओं को तहखाने झिल्ली निकालने (बीएमई) में एम्बेडेड किया जाता है और एक अच्छी तरह से परिभाषित सीरम-मुक्त सेल कल्चर माध्यम के साथ खिलाया जाता है। 3 डी ऑर्गेनोइड 7-10 दिनों के भीतर बढ़ते हैं, और परिणामस्वरूप गोलाकार संरचनाएं उपसंस्कृति, क्रायोप्रिजर्वेशन और सीएससी मार्करों, ईएमटी, ऑटोफैगी, प्रसार, भेदभाव और एपोप्टोटिक सेल डेथ सहित विभिन्न सेलुलर गुणों और कार्यों का विश्लेषण करने के लिए सहायक होती हैं।
इन विधियों को मोटे तौर पर किसी भी स्तरीकृत स्क्वैमस उपकला ऊतक से स्थापित 3 डी ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों पर लागू किया जा सकता है, जैसे कि सिर और गर्दन म्यूकोसा (मौखिक गुहा, जीभ, ग्रसनी, और स्वरयंत्र) और यहां तक कि फोरेडोमैक। सिर और गर्दन का म्यूकोसा अन्नप्रणाली के साथ सन्निहित हैं, और दो ऊतक समान ऊतक संगठन, कार्य और बीमारी के लिए संवेदनशीलता साझा करते हैं। सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (एचएनएससीसी) और ईएससीसी दोनों आनुवंशिक घावों और जीवनशैली से संबंधित पर्यावरणीय जोखिम कारकों जैसे तंबाकू और शराब के जोखिम को साझा करते हैं। इस समानता को रेखांकित करते हुए, तंबाकू के धुएं के मिमेटिक 4एनक्यूओ के साथ इलाज किए गए चूहे आसानी से एचएनएससीसी और ईएससीसी दोनों विकसित करते हैं। जिस आसानी से नीचे वर्णित प्रोटोकॉल को एचएनएससीसी मॉडलिंग पर लागू किया जा सकता है, हम इन घावों से 3 डी ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए विशिष्ट निर्देश शामिल करते हैं।
यहां, हम सामान्य, प्रीनोप्लास्टिक और ईएससीसी घावों का प्रतिनिधित्व करने वाले मुराइन एसोफैगल 3 डी ऑर्गेनोइड्स (एमईओ) उत्पन्न करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जो 4 एनक्यूओ के साथ इलाज किए गए चूहों में विकसित होते हैं। विभिन्न माउस उपभेदों का उपयोग किया जा सकता है, जिसमें सामान्य प्रयोगशाला उपभेद जैसे सी 57बीएल / 6 और सेल वंश-ट्रेसेबल और अन्य आनुवंशिक रूप से इंजीनियर डेरिवेटिव शामिल हैं। हम सामान्य या रोगग्रस्त मुराइन एसोफैगल एपिथेलियम के अलगाव, एकल-कोशिका निलंबन की तैयारी, बढ़ते 3 डी ऑर्गेनोइड्स की खेती और निगरानी, उपसंस्कृति, क्रायोप्रिजर्वेशन और आकृति विज्ञान और अन्य अनुप्रयोगों सहित बाद के विश्लेषणों के लिए प्रसंस्करण सहित प्रमुख चरणों पर जोर देते हैं।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल में एमईओ के उत्पादन और विश्लेषण के लिए कई महत्वपूर्ण कदम और विचार हैं। एमईओ प्रयोगों में प्रजनन क्षमता और कठोरता सुनिश्चित करने के लिए, जैविक और तकनीकी प्रतिकृतियां दोनों महत्व…
The authors have nothing to disclose.
हम तकनीकी सहायता के लिए कोलंबिया विश्वविद्यालय में हर्बर्ट इरविंग कॉम्प्रिहेंसिव कैंसर सेंटर में साझा संसाधनों (फ्लो साइटोमेट्री, आणविक पैथोलॉजी, और कॉन्फोकल और विशेष माइक्रोस्कोपी) को धन्यवाद देते हैं। हम सहायक चर्चाओं के लिए डॉ एलन डिहल, एडम जे बास, और क्वोक-किन वोंग (एनसीआई पी 01 तंत्र ऑफ एसोफैगल कार्सिनोजेनेसिस) और रुस्तगी और नाकागावा प्रयोगशालाओं के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को निम्नलिखित एनआईएच अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था: P01CA098101 (H.N. और A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.), 2401874 (F.M.H.)
(जे.जी.) R01CA266978 (C.L.), R01DK132251 (C.L.), R01DE031873 (C.L.), P30DK132710 (C.M. और H.N.), और P30CA013696 (A.K.R.) एच.एन. और सी.एल. कोलंबिया विश्वविद्यालय हर्बर्ट इरविंग कॉम्प्रिहेंसिव कैंसर सेंटर मल्टी-पीआई पायलट अवार्ड के प्राप्तकर्ता हैं। एच.एन. फैनकोनी एनीमिया रिसर्च फंड अवार्ड के प्राप्तकर्ता हैं। एफएमएच द मार्क फाउंडेशन फॉर कैंसर रिसर्च अवार्ड (20-60-51-एमओएमई) और अमेरिकन एसोसिएशन फॉर कैंसर रिसर्च अवार्ड के प्राप्तकर्ता हैं। जेजी अमेरिकन गैस्ट्रोएंटेरोलॉजी एसोसिएशन (एजीए) पुरस्कार के प्राप्तकर्ता हैं।
0.05% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-300-120 | |
0.25% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-200-114 | |
0.4% Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
1 mL tuberculin syringe without needle | BD | 309659 | |
1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
100 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | |
15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-53A | |
200 µL wide bore micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | 212361A | |
21 G needles | BD | 305167 | |
24 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12-556-006 | |
4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO) | Tokyo Chemical Industry | NO250 | |
50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 12-565-270 | |
6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12556004 | |
70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
99.9% ethylene propylene glycol | SK picglobal | ||
Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
Amphotericin B | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL |
Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
Bacto agar | BD | 214010 | |
CO2 incubator, e.g.Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026406 | or equivalent |
Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | or equivalent |
Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 03-337-7D | |
DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
Dispase | Corning | 354235 | Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL |
Dissecting scissors | VWR | 25870-002 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Stock concentration 1x |
Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
Forceps | VWR | 82027-386 | |
Freezing container | Corning | 432002 | or equivalent |
Gelatin | Thermo Fisher Scientific | G7-500 | |
GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
Hot plate/stirrer | Corning | PC-420D | or equivalent |
Lab Armor bead bath (or water bath) | VWR | 89409-222 | or equivalent |
Laboratory balance | Ohaus | 71142841 | or equivalent |
Matrigel basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | |
Microcentrifuge Minispin | Eppendorf | 22620100 | or equivalent |
Microcentrifuge tube rack | Southern Labware | 0061 | |
N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
N-acetylcysteine (NAC) | Sigma-Aldrich | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
Parafilm M wrap | Thermo Fisher Scientific | S37440 | |
Paraformaldehyde (PFA) | MilliporeSigma | 158127-500G | |
Pathology cassette | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
Phase-contrast microscope | Nikon | or equivalent | |
Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL |
RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM) | N/A | N/A | Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2% |
Sorval ST 16R centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | or equivalent |
Soybean trypsin inhibitor (STI) | MilliporeSigma | T9128 | Stock concentration 250 µg/mL |
ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | or equivalent |
Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |