Långtidsodling och övervakning av isolerade Caenorhabditis elegans på fasta medier i flerbrunnsenheter
Summary
Här presenteras ett optimerat protokoll för odling av isolerade enskilda nematoder på fasta medier i mikrofabricerade flerbrunnsanordningar. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt för enskilda djur att övervakas under hela livet för en mängd olika fenotyper relaterade till åldrande och hälsa, inklusive aktivitet, kroppsstorlek och form, rörelsegeometri och överlevnad.
Abstract
Nematoden Caenorhabditis elegans är bland de vanligaste modellsystemen som används inom åldringsforskning på grund av dess enkla och billiga odlingstekniker, snabba reproduktionscykel (~3 dagar), korta livslängd (~3 veckor) och många tillgängliga verktyg för genetisk manipulation och molekylär analys. Det vanligaste tillvägagångssättet för att genomföra åldringsstudier i C. elegans, inklusive överlevnadsanalys, innebär odling av populationer av tiotals till hundratals djur tillsammans på fasta nematodtillväxtmedier (NGM) i Petri-plattor. Även om detta tillvägagångssätt samlar in data om en population av djur, spårar de flesta protokoll inte enskilda djur över tid. Här presenteras ett optimerat protokoll för långsiktig odling av enskilda djur på mikrofabricerade polydimetylsiloxanenheter (PDMS) som kallas WorMotels. Varje anordning gör det möjligt att odla upp till 240 djur i små brunnar som innehåller NGM, där varje brunn isoleras av en kopparsulfathaltig vallgrav som hindrar djuren från att fly. Baserat på den ursprungliga WorMotel-beskrivningen ger detta dokument ett detaljerat protokoll för gjutning, förberedelse och fyllning av varje enhet, med beskrivningar av vanliga tekniska komplikationer och råd för felsökning. Inom detta protokoll finns tekniker för konsekvent laddning av NGM med små volymer, konsekvent torkning av både NGM och bakteriemat, alternativ för att leverera farmakologiska ingrepp, instruktioner för och praktiska begränsningar för återanvändning av PDMS-enheter och tips för att minimera uttorkning, även i miljöer med låg luftfuktighet. Denna teknik möjliggör longitudinell övervakning av olika fysiologiska parametrar, inklusive stimulerad aktivitet, ostimulerad aktivitet, kroppsstorlek, rörelsegeometri, hälsospan och överlevnad, i en miljö som liknar standardtekniken för gruppkultur på fasta medier i Petri-plattor. Denna metod är kompatibel med datainsamling med hög genomströmning när den används tillsammans med automatiserad mikroskopi och analysprogramvara. Slutligen diskuteras begränsningarna med denna teknik, liksom en jämförelse av detta tillvägagångssätt med en nyligen utvecklad metod som använder mikrobrickor för att odla isolerade nematoder på fasta medier.
Introduction
Caenorhabditis elegans används ofta i åldrandestudier på grund av deras korta generationstid (cirka 3 dagar), korta livslängd (cirka 3 veckor), enkel odling i laboratoriet, hög grad av evolutionärt bevarande av molekylära processer och vägar med däggdjur och bred tillgänglighet av genetiska manipulationstekniker. I samband med åldrandestudier möjliggör C. elegans snabb generering av livslängdsdata och åldrade populationer för analys av sena fenotyper hos levande djur. Det typiska tillvägagångssättet för att genomföra maskåldringsstudier innefattar manuell mätning av livslängden hos en population av maskar som hålls i grupper om 20 till 70 djur på fasta agarnematodtillväxtmedier (NGM) i 6 cm Petri-plattor1. Genom att använda ålderssynkroniserade populationer kan man mäta livslängden eller tvärsnittsfenotyper hos enskilda djur över hela populationen, men denna metod utesluter övervakning av enskilda djurs egenskaper över tid. Detta tillvägagångssätt är också arbetsintensivt, vilket begränsar storleken på befolkningen som kan testas.
Det finns ett begränsat antal odlingsmetoder som möjliggör longitudinell övervakning av enskilda C. elegans under hela deras livslängd, och var och en har en distinkt uppsättning fördelar och nackdelar. Mikrofluidikanordningar, inklusive WormFarm2, NemaLife3 och “beteende” chip4, bland annat 5,6,7, möjliggör övervakning av enskilda djur över tid. Odling av maskar i flytande kultur med flerbrunnsplattor möjliggör på liknande sätt övervakning av antingen enskilda djur eller små populationer av C. elegans över tiden 8,9. Den flytande miljön representerar ett distinkt miljösammanhang från den vanliga odlingsmiljön på fasta medier i Petri-plattor, vilket kan förändra aspekter av djurfysiologi som är relevanta för åldrande, inklusive fettinnehåll och uttryck av stressresponsgener10,11. Möjligheten att direkt jämföra dessa studier med majoriteten av data som samlats in om åldrande C. elegans begränsas av skillnader i potentiellt viktiga miljövariabler. Worm Corral12 är ett tillvägagångssätt som utvecklats för att hysa enskilda djur i en miljö som närmare replikerar typisk solid mediekultur. Worm Corral innehåller en förseglad kammare för varje djur på ett mikroskopglas med hydrogel, vilket möjliggör longitudinell övervakning av isolerade djur. Denna metod använder standard ljusfältsavbildning för att registrera morfologiska data, såsom kroppsstorlek och aktivitet. Djur placeras dock i hydrogelmiljön som embryon, där de förblir ostörda under hela sin livslängd. Detta kräver användning av villkorligt steril mutant eller transgen genetisk bakgrund, vilket begränsar både kapaciteten för genetisk screening, eftersom varje ny mutation eller transgen måste korsas in i en bakgrund med villkorlig sterilitet, och kapaciteten för läkemedelsscreening, eftersom behandlingar endast kan tillämpas en gång på djuren som embryon.
En alternativ metod som utvecklats av Fang-Yen-laboratoriet möjliggör odling av maskar på fasta medier i enskilda brunnar i en mikrofabricerad polydimetylsiloxan (PDMS) -anordning som kallas WorMotel13,14. Varje enhet placeras i en bricka med en brunn (dvs. med samma dimensioner som en 96-brunnsplatta) och har 240 brunnar åtskilda av en vallgrav fylld med en aversiv lösning för att förhindra att maskarna reser mellan brunnar. Varje brunn kan hysa en enda mask under hela sin livslängd. Enheten är omgiven av vattenabsorberande polyakrylamidgelpellets (kallad “vattenkristaller”) och brickan är förseglad med Parafilm laboratoriefilm för att bibehålla fuktigheten och minimera uttorkningen av mediet. Detta system gör det möjligt att samla in data om hälsa och livslängd för enskilda djur, medan användningen av fasta medier bättre rekapitulerar miljön som djuren upplever i de allra flesta publicerade C. elegans livslängdsstudier, vilket möjliggör mer direkta jämförelser. Nyligen har en liknande teknik utvecklats med användning av polystyrenmikrobrickor som ursprungligen användes för mikrocytotoxicitetsanalyser15 i stället för PDMS-enheten16. Mikrobrickmetoden möjliggör insamling av individualiserade data för maskar odlade på fasta medier och har förbättrad kapacitet för att innehålla maskar under förhållanden som vanligtvis skulle orsaka flykt (t.ex. stressorer eller kostbegränsning), med avvägningen att varje mikrobricka endast kan innehålla 96 djur16, medan multibrunnsenheten som används här kan innehålla upp till 240 djur.
Här presenteras ett detaljerat protokoll för beredning av flerbrunnsenheter som är optimerat för platt-till-platt-konsistens och förberedelse av flera enheter parallellt. Detta protokoll anpassades från det ursprungliga protokollet från Fang-Yen-laboratoriet13. Specifikt finns det beskrivningar för tekniker för att minimera kontaminering, optimera konsekvent torkning av både det fasta mediet och den bakteriella matkällan och leverera RNAi och läkemedel. Detta system kan användas för att spåra individuell hälsa, livslängd och andra fenotyper, såsom kroppsstorlek och form. Dessa multi-well-enheter är kompatibla med befintliga system med hög genomströmning för att mäta livslängden, vilket kan ta bort mycket av det manuella arbetet som är involverat i traditionella livslängdsexperiment och ge möjlighet till automatiserad, direkt livslängdsmätning och hälsospårning i enskilda C. elegans i stor skala.
Protocol
Representative Results
Discussion
WorMotel-systemet är ett kraftfullt verktyg för att samla in individualiserade data för hundratals isolerade C. elegans över tid. Efter de tidigare studierna med multibrunnsenheter för applikationer inom utvecklingslugn, rörelsebeteende och åldrande var målet med detta arbete att optimera förberedelsen av flerbrunnsenheter för långsiktig övervakning av aktivitet, hälsa och livslängd på ett högre genomströmningssätt. Detta arbete ger ett detaljerat protokoll för att förbereda flerbrunnsenheter…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH R35GM133588 till G.L.S., en United States National Academy of Medicine Catalyst Award till G.L.S., State of Arizona Technology and Research Initiative Fund administrerad av Arizona Board of Regents och Ellison Medical Foundation.
Materials
| 2.5 lb weight | CAP Barbell | RP-002.5 | |
| Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in) | Falken Design | ACRYLIC-CL-3-8/1224 | Large sheet cut to smaller sizes |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Autoclavable squeeze bottle | Nalgene | 2405-0500 | |
| Bacto agar | BD Difco | 214030 | |
| Bacto peptone | Thermo Scientific | 211677 | |
| Basin, 25 mL | VWR | 89094-664 | Disposable pipette basin |
| Cabinet style vacuum desiccator | SP Bel-Art | F42400-4001 | Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber. |
| CaCl2 | Acros Organics | 349615000 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 | Wildtype strain |
| Carbenicillin | GoldBio | C-103-25 | |
| Centrifuge | Beckman | 360902 | |
| Cholesterol | ICN Biomedicals Inc | 101380 | |
| Compressed oxygen tank | Airgas | UN1072 | |
| CuSO4 | Fisher Chemical | C493-500 | |
| Dry bead bath incubator | Fisher Scientific | 11-718-2 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Standard labratory food for C. elegans |
| Ethanol | Millipore | ex0276-4 | |
| Floxuridine | Research Products International | F10705-1.0 | |
| Hybridization oven | Techne | 731-0177 | Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice |
| Incubators | Shel Lab | 2020 | 20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | GoldBio | I2481C100 | |
| K2HPO4 | Fisher Chemical | P288-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemical | P286-1 | |
| Kimwipes | KimTech | 34155 | Task wipes |
| LB Broth, Lennox | BD Difco | 240230 | |
| Low melt agarose | Research Products International | A20070-250.0 | |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M-8900 | |
| Microwave | Sharp | R-530DK | |
| Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3 | Rainin | 17013800 | The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided |
| NaCl | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Nunc OmniTray | Thermo Scientific | 264728 | Clear polystyrene trays |
| Parafilm M | Fisher Scientific | 13-374-10 | Double-wide (4 in) |
| Petri plate, 100 mM | VWR | 25384-342 | |
| Petri plate, 60 mM | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Plasma cleaner | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
| PLATINUM vacuum pump | JB Industries | DV-142N | |
| PolyJet 3D printer | Stratasys | Objet500 Connex3 | PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi) |
| Shaking incubator | Lab-Line | 3526CC | |
| smartSpatula | LevGo, Inc. | 17211 | Disposable spatula |
| Superabsorbent polymer (AgSAP Type S) | M2 Polymer Technologies | Type S | Referred to in main text as "water crystals" |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer base | The Dow Chemical Company | 2065622 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent | The Dow Chemical Company | 2085925 | |
| Syringe filter (0.22 µm) | Nest Scientific USA Inc. | 380111 | |
| Syringe, 10 mL | Fisher Scientific | 14955453 | |
| TWEEN 20 | Thermo Scientific | J20605-AP | Detergent |
| Vacuum pump oil | VWR | 54996-082 | |
| VeroBlackPlus | Stratasys | RGD875 | Rigid 3D printing filament |
| Weigh boat | Thermo Scientific | WB30304 | Large enough for PDMS mixture volume |
Riferimenti
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
- Rahman, M., et al. NemaLife chip: A micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10, 16190 (2020).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A., Liu, X., Sun, Y. Microfluidic devices for imaging and manipulation of C. elegans. Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. 13, 295-321 (2021).
- Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
- Atakan, H. B., et al. Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms. Scientific Reports. 9, 14340 (2019).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).
- Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).
- Çelen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).
- Pittman, W. E., et al. A simple apparatus for individual C. elegans culture. Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Jushaj, A., et al. Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system. PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).
- Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test. Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).
- Espejo, L., et al. Long-term culture of individual Caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Freitas, S. Worm Paparazzi – A high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans. University of Arizona. , (2021).
- Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. WormSizer: High-throughput analysis of nematode size and shape. PLoS One. 8 (2), e57142 (2013).
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , (2013).
- Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends. Worm. 3 (4), 982437 (2014).
- Grubbs, J. J., vander Linden, A. M., Raizen, D. M. Regulation of sleep by KIN-29 is not developmental. microPublication Biology. 2020, (2020).
- Iannacone, M. J., et al. The RFamide receptor DMSR-1 regulates stress-induced sleep in C. elegans. eLife. 6, 19837 (2017).
- McClanahan, P. D., et al. A quiescent state following mild sensory arousal in Caenorhabditis elegans is potentiated by stress. Scientific Reports. 10, 4140 (2020).
- Churgin, M. A., McCloskey, R. J., Peters, E., Fang-Yen, C. Antagonistic serotonergic and octopaminergic neural circuits mediate food-dependent locomotory behavior in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 37 (33), 7811-7823 (2017).
- Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
- Murphy, C. T., et al. Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans. Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).
- Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: Microfluidic chambers for performing lifelong observation of C . elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
- Lionaki, E., Tavernarakis, N. High-throughput and longitudinal analysis of aging and senescent decline in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 965, 485-500 (2013).
- Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C. elegans under dietary restriction. The Journal of Experimental Biology. 209, 4129-4139 (2006).
- Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. The Journal of Experimental Biology. 211, 3703-3711 (2008).
- Hartman, J. H., et al. Swimming exercise and transient food deprivation in Caenorhabditis elegans promote mitochondrial maintenance and protect against chemical-induced mitotoxicity. Scientific Reports. 8, 8359 (2018).
- Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).
