Coltura a lungo termine e monitoraggio di Caenorhabditis elegans isolati su terreni solidi in dispositivi multi-pozzetto
Summary
Qui viene presentato un protocollo ottimizzato per la coltura di singoli nematodi isolati su supporti solidi in dispositivi multipozzetto microfabbricati. Questo approccio consente ai singoli animali di essere monitorati per tutta la vita per una varietà di fenotipi legati all’invecchiamento e alla salute, tra cui attività, dimensioni e forma del corpo, geometria del movimento e sopravvivenza.
Abstract
Il nematode Caenorhabditis elegans è tra i sistemi modello più comuni utilizzati nella ricerca sull’invecchiamento grazie alle sue tecniche di coltura semplici e poco costose, al ciclo di riproduzione rapido (~ 3 giorni), alla breve durata della vita (~ 3 settimane) e ai numerosi strumenti disponibili per la manipolazione genetica e l’analisi molecolare. L’approccio più comune per condurre studi sull’invecchiamento in C. elegans, compresa l’analisi di sopravvivenza, prevede la coltura di popolazioni da decine a centinaia di animali insieme su terreni di crescita di nematodi solidi (NGM) in piastre di Petri. Mentre questo approccio raccoglie dati su una popolazione di animali, la maggior parte dei protocolli non traccia i singoli animali nel tempo. Presentato qui è un protocollo ottimizzato per la coltura a lungo termine di singoli animali su dispositivi microfabbricati in polidimetilsilossano (PDMS) chiamati WorMotels. Ogni dispositivo consente di coltivare fino a 240 animali in piccoli pozzi contenenti NGM, con ogni pozzo isolato da un fossato contenente solfato di rame che impedisce agli animali di fuggire. Basandosi sulla descrizione originale di WorMotel, questo documento fornisce un protocollo dettagliato per lo stampaggio, la preparazione e il popolamento di ciascun dispositivo, con descrizioni di complicazioni tecniche comuni e consigli per la risoluzione dei problemi. All’interno di questo protocollo ci sono tecniche per il carico costante di piccoli volumi di NGM, l’essiccazione coerente sia dell’NGM che del cibo batterico, opzioni per fornire interventi farmacologici, istruzioni e limitazioni pratiche al riutilizzo dei dispositivi PDMS e suggerimenti per ridurre al minimo l’essiccazione, anche in ambienti a bassa umidità. Questa tecnica consente il monitoraggio longitudinale di vari parametri fisiologici, tra cui attività stimolata, attività non stimolata, dimensioni corporee, geometria del movimento, durata della salute e sopravvivenza, in un ambiente simile alla tecnica standard per la cultura di gruppo su supporti solidi in piastre di Petri. Questo metodo è compatibile con la raccolta di dati ad alto rendimento se utilizzato in combinazione con software di microscopia e analisi automatizzati. Infine, vengono discussi i limiti di questa tecnica, nonché un confronto di questo approccio con un metodo recentemente sviluppato che utilizza microvassoi per coltivare nematodi isolati su supporti solidi.
Introduction
I Caenorhabditis elegans sono comunemente usati negli studi sull’invecchiamento a causa del loro breve tempo di generazione (circa 3 giorni), breve durata della vita (circa 3 settimane), facilità di coltivazione in laboratorio, alto grado di conservazione evolutiva dei processi molecolari e dei percorsi con i mammiferi e ampia disponibilità di tecniche di manipolazione genetica. Nel contesto degli studi sull’invecchiamento, C. elegans consente la rapida generazione di dati sulla longevità e popolazioni invecchiate per l’analisi dei fenotipi in età avanzata negli animali vivi. L’approccio tipico per condurre studi sull’invecchiamento dei vermi prevede la misurazione manuale della durata della vita di una popolazione di vermi mantenuti in gruppi da 20 a 70 animali su terreni di crescita solidi di nematodi agar (NGM) in piastre di Petri da 6 cm1. L’utilizzo di popolazioni sincronizzate per età consente la misurazione della durata della vita o dei fenotipi trasversali nei singoli animali in tutta la popolazione, ma questo metodo preclude il monitoraggio delle caratteristiche dei singoli animali nel tempo. Questo approccio è anche ad alta intensità di manodopera, limitando così le dimensioni della popolazione che può essere testata.
Esistono un numero limitato di metodi di coltura che consentono il monitoraggio longitudinale dei singoli C. elegans per tutta la loro durata di vita, e ognuno ha una serie distinta di vantaggi e svantaggi. I dispositivi microfluidici, tra cui WormFarm2, NemaLife3 e il chip “behavior”4, tra gli altri 5,6,7, consentono il monitoraggio dei singoli animali nel tempo. La coltura di vermi in coltura liquida utilizzando piastre multi-pozzetto consente allo stesso modo il monitoraggio di singoli animali o piccole popolazioni di C. elegans nel tempo 8,9. L’ambiente liquido rappresenta un contesto ambientale distinto dall’ambiente di coltura comune su terreni solidi in piastre di Petri, che può alterare aspetti della fisiologia animale che sono rilevanti per l’invecchiamento, incluso il contenuto di grassi e l’espressione dei geni di risposta allo stress10,11. La capacità di confrontare direttamente questi studi con la maggior parte dei dati raccolti sull’invecchiamento di C. elegans è limitata dalle differenze nelle variabili ambientali potenzialmente importanti. Il Worm Corral12 è un approccio sviluppato per ospitare singoli animali in un ambiente che replica più da vicino la tipica cultura dei media solidi. Il Worm Corral contiene una camera sigillata per ogni animale su un vetrino da microscopio che utilizza idrogel, consentendo il monitoraggio longitudinale di animali isolati. Questo metodo utilizza l’imaging standard in campo chiaro per registrare dati morfologici, come le dimensioni e l’attività del corpo. Tuttavia, gli animali vengono collocati nell’ambiente idrogel come embrioni, dove rimangono indisturbati per tutta la durata della loro vita. Ciò richiede l’uso di background genetici mutanti o transgenici condizionatamente sterili, che limitano sia la capacità di screening genetico, poiché ogni nuova mutazione o transgene deve essere incrociato in uno sfondo con sterilità condizionale, sia la capacità di screening farmacologico, poiché i trattamenti possono essere applicati solo una volta agli animali come embrioni.
Un metodo alternativo sviluppato dal laboratorio Fang-Yen consente la coltivazione di vermi su supporti solidi in singoli pozzetti di un dispositivo microfabbricato in polidimetilsilossano (PDMS) chiamato WorMotel13,14. Ogni dispositivo è posto in un vassoio a pozzetto singolo (cioè con le stesse dimensioni di una piastra a 96 pozzetti) e ha 240 pozzi separati da un fossato riempito con una soluzione avversiva per impedire ai vermi di viaggiare tra i pozzi. Ogni pozzo può ospitare un singolo verme per tutta la durata della sua vita. Il dispositivo è circondato da pellet di gel di poliacrilammide che assorbono l’acqua (denominati “cristalli d’acqua”) e il vassoio è sigillato con pellicola da laboratorio Parafilm per mantenere l’umidità e ridurre al minimo l’essiccazione del supporto. Questo sistema consente di raccogliere dati sulla durata della salute e sulla durata della vita per i singoli animali, mentre l’uso di supporti solidi ricapitola meglio l’ambiente vissuto dagli animali nella stragrande maggioranza degli studi pubblicati sulla durata della vita di C. elegans, consentendo così confronti più diretti. Recentemente, una tecnica simile è stata sviluppata utilizzando microvassoi in polistirene originariamente utilizzati per i saggi di microcitotossicità15 al posto del dispositivo PDMS16. Il metodo del microvassoio consente la raccolta di dati individualizzati per i vermi coltivati su terreni solidi e ha migliorato la capacità di contenere i vermi in condizioni che tipicamente causerebbero la fuga (ad esempio, fattori di stress o restrizioni dietetiche), con il compromesso che ogni microvassoio può contenere solo 96 animali16, mentre il dispositivo multi-pozzo utilizzato qui può contenere fino a 240 animali.
Di seguito è presentato un protocollo dettagliato per la preparazione di dispositivi multi-pozzetto ottimizzato per la coerenza da piastra a piastra e la preparazione di più dispositivi in parallelo. Questo protocollo è stato adattato dal protocollo originale del laboratorio Fang-Yen13. In particolare, ci sono descrizioni per le tecniche per ridurre al minimo la contaminazione, ottimizzare l’essiccazione coerente sia dei mezzi solidi che della fonte di cibo batterico e fornire RNAi e farmaci. Questo sistema può essere utilizzato per monitorare la durata della salute individuale, la durata della vita e altri fenotipi, come le dimensioni e la forma del corpo. Questi dispositivi multi-pozzetto sono compatibili con i sistemi esistenti ad alta produttività per misurare la durata della vita, che possono rimuovere gran parte del lavoro manuale coinvolto negli esperimenti tradizionali sulla durata della vita e fornire l’opportunità di misurare la longevità automatizzata e diretta e il monitoraggio della salute nei singoli C. elegans su larga scala.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il sistema WorMotel è un potente strumento per raccogliere dati individualizzati per centinaia di C. elegans isolati nel tempo. A seguito degli studi precedenti che utilizzavano dispositivi multi-pozzetto per applicazioni nella quiescenza dello sviluppo, nel comportamento locomotore e nell’invecchiamento, l’obiettivo di questo lavoro era ottimizzare la preparazione di dispositivi multi-pozzo per il monitoraggio a lungo termine di attività, salute e durata della vita in modo più elevato. Questo lavoro fornisce…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da NIH R35GM133588 a G.L.S., un premio catalizzatore della National Academy of Medicine degli Stati Uniti a G.L.S., lo State of Arizona Technology and Research Initiative Fund amministrato dall’Arizona Board of Regents e la Ellison Medical Foundation.
Materials
| 2.5 lb weight | CAP Barbell | RP-002.5 | |
| Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in) | Falken Design | ACRYLIC-CL-3-8/1224 | Large sheet cut to smaller sizes |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Autoclavable squeeze bottle | Nalgene | 2405-0500 | |
| Bacto agar | BD Difco | 214030 | |
| Bacto peptone | Thermo Scientific | 211677 | |
| Basin, 25 mL | VWR | 89094-664 | Disposable pipette basin |
| Cabinet style vacuum desiccator | SP Bel-Art | F42400-4001 | Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber. |
| CaCl2 | Acros Organics | 349615000 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 | Wildtype strain |
| Carbenicillin | GoldBio | C-103-25 | |
| Centrifuge | Beckman | 360902 | |
| Cholesterol | ICN Biomedicals Inc | 101380 | |
| Compressed oxygen tank | Airgas | UN1072 | |
| CuSO4 | Fisher Chemical | C493-500 | |
| Dry bead bath incubator | Fisher Scientific | 11-718-2 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Standard labratory food for C. elegans |
| Ethanol | Millipore | ex0276-4 | |
| Floxuridine | Research Products International | F10705-1.0 | |
| Hybridization oven | Techne | 731-0177 | Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice |
| Incubators | Shel Lab | 2020 | 20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | GoldBio | I2481C100 | |
| K2HPO4 | Fisher Chemical | P288-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemical | P286-1 | |
| Kimwipes | KimTech | 34155 | Task wipes |
| LB Broth, Lennox | BD Difco | 240230 | |
| Low melt agarose | Research Products International | A20070-250.0 | |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M-8900 | |
| Microwave | Sharp | R-530DK | |
| Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3 | Rainin | 17013800 | The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided |
| NaCl | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Nunc OmniTray | Thermo Scientific | 264728 | Clear polystyrene trays |
| Parafilm M | Fisher Scientific | 13-374-10 | Double-wide (4 in) |
| Petri plate, 100 mM | VWR | 25384-342 | |
| Petri plate, 60 mM | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Plasma cleaner | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
| PLATINUM vacuum pump | JB Industries | DV-142N | |
| PolyJet 3D printer | Stratasys | Objet500 Connex3 | PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi) |
| Shaking incubator | Lab-Line | 3526CC | |
| smartSpatula | LevGo, Inc. | 17211 | Disposable spatula |
| Superabsorbent polymer (AgSAP Type S) | M2 Polymer Technologies | Type S | Referred to in main text as "water crystals" |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer base | The Dow Chemical Company | 2065622 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent | The Dow Chemical Company | 2085925 | |
| Syringe filter (0.22 µm) | Nest Scientific USA Inc. | 380111 | |
| Syringe, 10 mL | Fisher Scientific | 14955453 | |
| TWEEN 20 | Thermo Scientific | J20605-AP | Detergent |
| Vacuum pump oil | VWR | 54996-082 | |
| VeroBlackPlus | Stratasys | RGD875 | Rigid 3D printing filament |
| Weigh boat | Thermo Scientific | WB30304 | Large enough for PDMS mixture volume |
Riferimenti
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