Analisi di campioni di rizoma di Cyperi grezzi e lavorati mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem in ratti con dismenorrea primaria

Summary

Qui, viene presentata un’analisi comparativa di campioni grezzi e lavorati di rizoma di Cyperi (CR) utilizzando la spettrometria di massa tandem ad altissima prestazione per cromatografia liquida ad alta risoluzione (UPLC-MS / MS) nei ratti con dismenorrea primaria. Le variazioni dei livelli ematici dei metaboliti e dei costituenti del campione sono state esaminate tra ratti trattati con CR e CR trattati con aceto (CRV).

Abstract

Cyperi rhizoma (CR) è ampiamente usato in ginecologia ed è una medicina generale per il trattamento delle malattie delle donne in Cina. Poiché l’effetto analgesico della CR è potenziato dopo la lavorazione con aceto, la CR elaborata con aceto (CRV) viene generalmente utilizzata clinicamente. Tuttavia, il meccanismo con cui l’effetto analgesico è potenziato dalla lavorazione dell’aceto non è chiaro. In questo studio, la tecnica di spettrometria di massa tandem per cromatografia liquida ad altissima pressione (UPLC-MS/MS) è stata utilizzata per esaminare i cambiamenti nei livelli ematici dei costituenti esogeni e dei metaboliti tra ratti trattati con CR e ratti trattati con CRV con dismenorrea. I risultati hanno rivelato livelli diversi di 15 costituenti e due metaboliti nel sangue di questi ratti. Tra questi, i livelli di (-)-mirtenolo e acido [(1R,2S,3R,4R)-3-idrossi-1,4,7,7-tetrametilbiciclo[2.2.1]ep-2-il]acetico nel gruppo CRV erano considerevolmente più alti rispetto al gruppo CR. Il CRV ha ridotto il livello di prostanoidi della serie 2 e dei leucotrieni della serie 4 con attività proinfiammatorie, di aggregazione piastrinica e di vasocostrizione e ha fornito effetti analgesici modulando il metabolismo dell’acido arachidonico e dell’acido linoleico e la biosintesi degli acidi grassi insaturi. Questo studio ha rivelato che la lavorazione dell’aceto migliora l’effetto analgesico della CR e contribuisce alla nostra comprensione del meccanismo d’azione del CRV.

Introduction

La dismenorrea primaria (PD) è la condizione più diffusa in ginecologia clinica. È caratterizzata da mal di schiena, gonfiore, dolore addominale o disagio prima o durante le mestruazioni senza patologia pelvica nel sistema riproduttivo¹. Un rapporto sulla sua prevalenza ha mostrato che l’85,7% degli studenti soffre di PD². I contraccettivi orali a basso dosaggio sono la terapia standard, ma i loro effetti collaterali avversi, come la trombosi venosa profonda, hanno attirato una crescente attenzione³. La prevalenza della trombosi venosa profonda tra gli utilizzatori di contraccettivi orali è di >1 per 1.000 donne e il rischio è più alto durante i primi 6-12 mesi e negli utenti di età superiore ai 40 anni⁴.

A lungo utilizzato nella medicina tradizionale cinese (MTC), Cyperi rhizoma (CR) deriva dal rizoma essiccato del Cyperus rotundus L. della famiglia delle Cyperaceae. La CR regola i disturbi mestruali e allevia la depressione e il dolore⁵. La CR è ampiamente usata in ginecologia ed è considerata una medicina generale per il trattamento delle malattie femminili⁶. La CR trattata con aceto (CRV) è tipicamente utilizzata clinicamente. Rispetto alla CR, la CRV mostra una maggiore regolazione delle mestruazioni e del sollievo dal dolore. Studi moderni hanno dimostrato che la CR inibisce la cicloossigenasi-2 (COX-2) e la successiva sintesi delle prostaglandine (PG), ottenendo così un effetto antinfiammatorio. Nel frattempo, CR mostra un effetto analgesico senza effetti collaterali⁷, rendendo CR una buona scelta per i pazienti con dismenorrea. Tuttavia, il meccanismo alla base della regolazione delle mestruazioni e della fornitura di sollievo dal dolore da parte della CRV non è chiaro. La ricerca sulla CR si è concentrata principalmente sui cambiamenti nei suoi componenti chimici attivi e nelle attività farmacologiche, come i suoi effetti antinfiammatori, antidepressivi e analgesici 8,9,10,11,12.

Sebbene gli ingredienti della MTC siano complessi, vengono assorbiti nel sangue e devono raggiungere una concentrazione ematica specifica per essere efficaci¹³. L’ambito dello screening dei principi attivi della MTC può essere ristretto utilizzando la strategia di determinazione dei costituenti nel sangue. La cecità può essere evitata nello studio dei componenti chimici in vitro e l’unilateralità può essere evitata nello studio dei singoli costituenti¹⁴. Confrontando le composizioni di CR e CRV nel sangue, i cambiamenti nei principi attivi della CR elaborata possono essere rilevati in modo efficace e rapido. L’efficacia del farmaco è il processo attraverso il quale un farmaco influenza il corpo. I cambiamenti nei componenti del farmaco dovuti alla risposta metabolica del corpo, che possono essere correlati al meccanismo d’azione del farmaco, possono essere determinati con la metabonomia. La metabonomica mira a misurare le risposte metaboliche complessive e dinamiche, il che è coerente con la determinazione dell’efficacia complessiva della medicina tradizionale cinese¹⁵. Inoltre, i metaboliti sono il prodotto finale dell’espressione genica, che è più strettamente correlata ai fenotipi¹⁶. Pertanto, la metabonomica può essere adatta per esplorare le differenze nelle vie metaboliche tra CR e CRV nel trattamento della malattia di Parkinson. La metabolomica non mirata basata sulla cromatografia liquida tandem ad alta risoluzione (LC-MS/MS) è caratterizzata da elevata produttività, alta sensibilità e alta risoluzione e può essere utilizzata per misurare molti diversi piccoli componenti molecolari^17,18 . Questo metodo può determinare simultaneamente i metaboliti endogeni e i costituenti esogeni assorbiti nel sangue. La metabonomica è stata ampiamente utilizzata negli studi su MTC¹⁹, tossicologia dei farmaci 20, gestione della salute 21, sport^{22, cibo 23} e altri campi.

In questo studio, le differenze nei costituenti esogeni assorbiti nel sangue e nei metaboliti endogeni sono state misurate tra ratti modello di dismenorrea trattati con CRV e dismenorrea trattati con CRV utilizzando metabolomica non mirata basata su LC-MS / MS per rivelare i meccanismi degli effetti analgesici del CRV.

Protocol

Tutti gli esperimenti relativi agli animali sono stati condotti con l’approvazione del Comitato etico degli esperimenti dell’Istituto di MTC di Chongqing. In questo esperimento sono stati utilizzati ventiquattro ratti femmina di Sprague Dawley (SD) che avevano 8-10 settimane e pesavano 200 g ± 20 g. 1. Preparazione dell’estrazione CalcoloPianificare la somministrazione dell’estratto di CR o CRV a un gruppo di trattamento di sei ratti Sprague-Dawley (10 g/[kg…

Representative Results

Analisi dell’esperimento modello di dismenorreaNon c’è stata alcuna risposta di contorsione entro 30 minuti nel gruppo di controllo perché questi ratti non sono stati iniettati per via intraperitoneale con ossitocina ed estradiolo benzoato per causare dolore. I ratti nei gruppi modello, CR e CRV hanno mostrato sostanziali reazioni di contorcersi dopo l’iniezione di ossitocina. Questi risultati dimostrano l’efficacia della combinazione di estradiolo benzoato e ossitocina per indurre dismenorrea. Le …

Discussion

A causa della grande varietà e della diversa natura dei TCM, queste erbe a volte non funzionano nella pratica clinica, e questo può essere dovuto alla lavorazione e al decotto inappropriati dei TCM. I meccanismi della MTC stanno diventando più evidenti con l’uso della scienza e della tecnologia contemporanee^29,30. Questo studio mostra che sia la CR che la CRV hanno effetti terapeutici nei ratti modello PD e che l’effetto terapeutico del CRV è più sostanziale…

Materials

Acetonitrile	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA	197164
BECKMAN COULTER Microfuge 20	Beckman Coulter, Inc.	MRZ15K047
Estradiol benzoate	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd	C10042616
formic acid	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA	177799
LC 30A system	Shimadzu, Kyoto, Japan	228-45162-46
Olive oil	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd	H25A11P111909
Oxytocin synthetic	Zhejiang peptide biology Co., Ltd	2019092001
Rat PGF2α ELISA kit	Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd	202101
Rat PGFE2 ELISA kit	Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd	EDL202006217
SPF Sprague-Dawley rats	Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd	Certificate number SCXK (Hunan) 2019-0004
Tecan Infinite 200 PRO	Tecan Austria GmbH, Austria	1510002987
Triple TOF 4600 system	SCIEX, Framingham, MA, USA	BK20641402
water	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA	152720