हम एक माइक्रोकंट्रोलर बोर्ड-लिंक्ड उपकरण का उपयोग करके स्टेंटर आदत को निर्धारित करने के लिए एक विधि पेश करते हैं जो एक निर्दिष्ट बल और आवृत्ति पर यांत्रिक दालों को वितरित कर सकता है। हम उपकरण को इकट्ठा करने और प्रयोग को इस तरह से स्थापित करने के तरीकों को भी शामिल करते हैं जो बाहरी गड़बड़ी को कम करता है।
सीखना आमतौर पर एक जटिल तंत्रिका तंत्र से जुड़ा होता है, लेकिन इस बात के प्रमाण बढ़ रहे हैं कि सभी स्तरों पर जीवन, एकल कोशिकाओं तक, बुद्धिमान व्यवहार प्रदर्शित कर सकता है। प्राकृतिक और कृत्रिम दोनों प्रणालियों में, सीखना नई जानकारी के आधार पर सिस्टम मापदंडों का अनुकूली अद्यतन है, और बुद्धि कम्प्यूटेशनल प्रक्रिया का एक उपाय है जो सीखने की सुविधा प्रदान करता है। स्टेंटर कोएरुलस एक एककोशिकीय तालाब में रहने वाला जीव है जो आदत प्रदर्शित करता है, सीखने का एक रूप जिसमें बार-बार उत्तेजना के बाद व्यवहार प्रतिक्रिया कम हो जाती है। स्टेंटर यांत्रिक उत्तेजना के जवाब में सिकुड़ता है, जो जलीय शिकारियों से एक स्पष्ट पलायन प्रतिक्रिया है। हालांकि, बार-बार कम-बल गड़बड़ी आदत को प्रेरित करती है, जो संकुचन की संभावना में प्रगतिशील कमी से प्रदर्शित होती है। यहां, हम एक माइक्रोकंट्रोलर बोर्ड-लिंक्ड उपकरण का उपयोग करके स्टेंटर आदत को निर्धारित करने के लिए एक विधि पेश करते हैं जो एक निर्दिष्ट बल और आवृत्ति पर यांत्रिक दालों को वितरित कर सकता है, जिसमें उपकरण के निर्माण और प्रयोग को इस तरह से स्थापित करने के तरीके शामिल हैं जो बाहरी गड़बड़ी को कम करता है। यांत्रिक रूप से स्टेंटर को उत्तेजित करने के लिए पहले वर्णित दृष्टिकोणों के विपरीत, यह उपकरण एक ही प्रयोग के दौरान कंप्यूटर नियंत्रण के तहत उत्तेजना के बल को भिन्न करने की अनुमति देता है, इस प्रकार इनपुट अनुक्रमों की विविधता में काफी वृद्धि होती है जिसे लागू किया जा सकता है। एकल कोशिका के स्तर पर आदत को समझना सीखने के प्रतिमानों को चिह्नित करने में मदद करेगा जो जटिल सर्किटरी से स्वतंत्र हैं।
सीखना आमतौर पर एक जटिल तंत्रिका तंत्र से जुड़ा होता है, लेकिन इस बात के प्रमाण बढ़ रहे हैं कि सभी स्तरों पर जीवन, एकल कोशिकाओं तक, बुद्धिमान व्यवहार प्रदर्शित कर सकता है। प्राकृतिक और कृत्रिम दोनों प्रणालियों में, सीखना नई जानकारी1 के आधार पर सिस्टम मापदंडों का अनुकूली अद्यतन है, और बुद्धि कम्प्यूटेशनल प्रक्रिया का एक उपाय है जो सीखने की सुविधा प्रदान करता है।
स्टेंटर कोरुलस एक एककोशिकीय तालाब में रहने वाला जीव है जो आदत प्रदर्शित करता है, सीखने का एक रूप जिसमें बार-बार उत्तेजना के बाद व्यवहार प्रतिक्रिया कम हो जातीहै। स्टेंटर यांत्रिक उत्तेजना 3 के जवाब मेंसिकुड़ता है, जो जलीय शिकारियों से एक स्पष्ट पलायन प्रतिक्रिया है। हालांकि, बार-बार कम-बल गड़बड़ी आदत को प्रेरित करती है, जो संकुचन संभावना 3 में प्रगतिशील कमी से प्रदर्शित होतीहै। उच्च-बल यांत्रिक उत्तेजना4 या फोटिक उत्तेजना 5 प्राप्त करने के बाद भी आदतयुक्त स्टेंटर सिकुड़जाता है। ये अवलोकन, जो जानवरों में आदत के लिए थॉम्पसन और स्पेंसर के क्लासिकमानदंडों के साथ संरेखित हैं, दृढ़ता से सुझाव देते हैं कि मूल सिकुड़ा हुआ प्रतिक्रिया ह्रास थकान या एटीपी की कमी के बजाय सीखने के कारण है। एक मुक्त-जीवित कोशिका के रूप में, स्टेंटर का अध्ययन आसपास की कोशिकाओं से बहुत हस्तक्षेप के बिना किया जा सकता है, जैसा कि एक बहुकोशिकीय ऊतक में होगा। कई अतिरिक्त विशेषताएं स्टेंटर को सीखने का अध्ययन करने के लिए एक व्यावहारिक प्रणाली बनाती हैं: इसका बड़ा आकार (1 मिमी), इसकी मात्रात्मक आदत प्रतिक्रिया3, इंजेक्शन और माइक्रोमैनिपुलेशन7 में आसानी, पूरी तरह से अनुक्रमित जीनोम8, और आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) उपकरण9 की उपलब्धता। मस्तिष्क या तंत्रिका तंत्र के बिना सेल सीखने का पता लगाने के लिए इस मॉडल जीव का उपयोग करने के लिए स्टेंटर कोशिकाओं को उत्तेजित करने और प्रतिक्रिया को मापने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रक्रिया की आवश्यकता होती है।
यहां, हम एक माइक्रोकंट्रोलर बोर्ड-लिंक्ड उपकरण का उपयोग करके स्टेंटर आदत को निर्धारित करने के लिए एक विधि पेश करते हैं जो एक निर्दिष्ट बल और आवृत्ति पर यांत्रिक दालों को वितरित कर सकता है, जिसमें उपकरण के निर्माण और प्रयोग को इस तरह से स्थापित करने के तरीके शामिल हैं जो बाहरी गड़बड़ी को कम करता है (चित्रा 1)। एकल कोशिका के स्तर पर आदत को समझना सीखने के प्रतिमानों को चिह्नित करने में मदद करेगा जो जटिल सर्किटरी से स्वतंत्र हैं।
चित्रा 1: आदत प्रयोग सेटअप। स्टेंटर युक्त पेट्री प्लेट को आदत डिवाइस के लचीले धातु शासक के ऊपर रखा जाता है। आदत उपकरण का आर्मेचर तब एक निर्दिष्ट बल और आवृत्ति पर धातु शासक से टकराता है, जिससे कोशिकाओं के क्षेत्र में एक उत्तेजना लहर पैदा होती है। यूएसबी माइक्रोस्कोप कैमरा उत्तेजना के लिए स्टेंटर की प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: आदत प्रयोग वर्कफ़्लो का सारांश। आंकड़ा आदत उपकरण का उपयोग करके स्टेंटर का अध्ययन करने में शामिल बुनियादी चरणों को दर्शाता है। यह आंकड़ा BioRender.com के साथ बनाया गया था। BioRender.com (2022) द्वारा “प्रोसेस फ्लोचार्ट” से अनुकूलित। https://app.biorender.com/biorender-templates से प्राप्त किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करने से संबंधित हैं कि स्टेंटर संकुचन होने के लिए इष्टतम परिस्थितियों में रहता है। आदत परख में संकुचन प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक है कि स्टेंटर्स को उनके चिपचिपे होल्डफास्ट का उपयोग करके सतह पर लंगर डाला जाता है क्योंकि जब वे स्वतंत्र रूप से तैर रहे होते हैं तो वे शायद ही कभी अनुबंध करते हैं। हालांकि, आदत प्रयोगों के लिए उपयोग की जाने वाली 35 मिमी पेट्री प्लेट की निचली सतह आमतौर पर लंगर डालने के लिए अनुकूल नहीं होती है जब तक कि पॉली-ऑर्निथिन के साथ लेपित न हो। इसके अलावा, स्टेंटर को आदत प्रयोग की शुरुआत से पहले कम से कम 2 घंटे के लिए किसी भी यांत्रिक गड़बड़ी के संपर्क में नहीं लाया जा सकता है क्योंकि स्टेंटर भूलने का टाइमस्केल 2-6 घंटे3 है। यदि स्टेंटर को आदत प्रयोग शुरू होने के समय के 2 घंटे के भीतर यांत्रिक उत्तेजना प्राप्त होती है, तो संभावना है कि यह पूर्व उत्तेजना प्रयोग से पहले आदत के मामूली स्तर को प्रेरित करेगी, जिससे आदत उपकरण द्वारा पहली यांत्रिक पल्स देने के बाद संकुचन की संभावना कम हो जाएगी। अंत में, विश्लेषण चरण के दौरान, केवल पल्स डिलीवरी से पहले होने वाले किसी भी आकस्मिक सहज संकुचन के बजाय पल्स के बाद अनुबंधित स्टेंटर की संख्या की गणना करना महत्वपूर्ण है – यांत्रिक उत्तेजना के जवाब में अनुबंधित कोशिकाओं के अंश का सटीक रीडआउट प्राप्त करने के लिए।
प्रोटोकॉल को आदत उपकरण द्वारा वितरित यांत्रिक दालों के बल और आवृत्ति को बदलकर विभिन्न प्रकार की आदत गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है। यह अन्य प्रकार के सीखने का पता लगाने का अवसर भी प्रदान करता है, जैसे कि संवेदीकरण, जो स्टेंटर में हो सकता है। माइक्रोकंट्रोलर बोर्ड प्रोग्राम कोड को स्टेंटर को यांत्रिक नल के विभिन्न पैटर्न देने के लिए भी समायोजित किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल के साथ समस्या निवारण करने के लिए एक संभावित मुद्दा स्टेंटर एंकरिंग की कम आवृत्ति है, जो स्टेंटर की संख्या को बाधित कर सकता है जिसे आदत प्रयोग में देखा जा सकता है। एंकरिंग आवृत्ति कभी-कभी स्टेंटर संस्कृतियों में कम हो जाती है जिन्हें हाल ही में खिलाया नहीं गया है या दूषित हैं। इस समस्या को हल करने के लिए, एक नई संस्कृति शुरू करने के लिए स्टेंटर के एक नए बैच को धोना चाहिए और लिन एट अल .10 में वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार उन्हें नियमित रूप से खिलाना चाहिए।
यह प्रोटोकॉल सीमित है कि स्टेंटर की केवल एक प्लेट का एक समय में परीक्षण किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप अपेक्षाकृत कम-थ्रूपुट माप होते हैं। इसके अलावा, वर्तमान सॉफ्टवेयर एकल-सेल छवि विश्लेषण के स्वचालन के लिए अनुमति नहीं देता है। इसलिए, प्राप्त किए गए अधिकांश डेटा जनसंख्या स्तर पर हैं। आदत डिवाइस और छवि विश्लेषण उपकरण के भविष्य के मॉडल उच्च-थ्रूपुट एकल-सेल प्रयोगों की सुविधा प्रदान कर सकते हैं।
स्टेंटर में आदत का अध्ययन पहले वुड3 द्वारा वर्णित तरीकों का उपयोग करके किया गया है, लेकिन यह नया प्रोटोकॉल प्रयोगों को स्वचालित होने की अनुमति देता है। स्वचालन न केवल शोधकर्ता को एक निर्दिष्ट बल और आवृत्ति की यांत्रिक दालों को पुन: वितरित करने की अनुमति देता है, बल्कि दीर्घकालिक आदत प्रयोगों की सुविधा भी देता है क्योंकि डिवाइस को दिनों तक पर्यवेक्षण के बिना चलाया जा सकता है। इसके अलावा, वुड केप्रयोगों 3 में नियोजित सोलनॉइड के बजाय स्टेपर मोटर का उपयोग करने से समय के साथ डिमैग्नेटाइजेशन का खतरा कम हो जाता है और एकल प्रयोग के दौरान उत्तेजना की ताकत को विविध होने की अनुमति मिलती है।
सेलुलर आदत का अध्ययन करने से ध्यान-घाटे / अति सक्रियता विकार (एडीएचडी) और टॉरेट सिंड्रोम जैसी स्थितियों के लिए नैदानिक अंतर्दृष्टि प्रकट हो सकती है जिसमेंआदत बिगड़ा हुआ है। स्टेंटर आदत तंत्र जटिल सेलुलर सर्किटरी से स्वतंत्र नए गैर-सिनैप्टिक सीखने के प्रतिमानों का भी अनावरण कर सकते हैं। अंत में, एकल-कोशिका सीखने के बारे में अंतर्दृष्टि बहुकोशिकीय ऊतकों के भीतर कोशिकाओं को पुन: प्रोग्राम करने के तरीकों को प्रेरित कर सकती है – बीमारी से लड़ने के लिए एक और संभावित एवेन्यू।
The authors have nothing to disclose.
हम स्टेंटर सीखने के बारे में असंख्य चर्चाओं के लिए तात्याना माकुशोक को धन्यवाद देते हैं। इस काम को एनएसएफ अनुदान एमसीबी-2012647 और एनआईएच अनुदान आर 35 जीएम 130327 द्वारा वित्त पोषित किया गया था, साथ ही फाउंडेशन फोरमेंटिन-गिल्बर्ट से आई 2सेल पुरस्कार द्वारा भी।
0.01% Poly-ornithine | Millipore Sigma | P4957 | Used to coat Petri plate |
35-mm Petri plate | Benz Microscope Optics Center Inc. | L331 | Contains Stentor during experiments |
6-well plate | StemCell Technologies | 38016 | Used to wash Stentor |
Aluminum breadboard, 4" x 24" x 1/2" (x1) | Thorlabs | MB424 | Used to construct habituation device |
Big easy driver stepper motor driver board (x1) | Sparkfun | ROB-12859 | Used to construct habituation device |
Construction rail, 1" x 5'' (x2) | Newport | Newport CR-1 | Used to construct habituation device |
Laptop | Apple Store | https://www.apple.com/macbook-air-m1/ | Connect laptop to USB microscope to visualize experiments |
Large right-angle bracket (x1) | Thorlabs | AP90RL | Used to construct habituation device |
Microcontroller board | Arduino | A000066 | Used to control habituation device |
Nema 17 Stepper Motor Bipolar 59Ncm 2A 84oz.in 48mm 4-Lead | Stepperonline.com | 5-17HS19-2004S1 | Used to construct habituation device |
Pasteurized spring water | Carolina | 132458 | Media for Stentor experiments |
Right-angle bracket (x3) | Thorlabs | AP90 | Used to construct habituation device |
Stemi 2000 stereo microscope | Zeiss | Used to visualize Stentor during wash steps | |
Stentor coeruleus | Carolina | 131598 | These are the cells used for habituation experiments |
USB microscope | Celestron | 44308 | Used to visualize and record experiments |
Webcam recorder | Apple Store | https://apps.apple.com/us/app/webcam-recorder/id1508067444?mt=12 | Install this application to take videos of experiments |