Vi introduserer en metode for å kvantifisere Stentor habituation ved hjelp av et mikrokontrollerkortkoblet apparat som kan levere mekaniske pulser med en spesifisert kraft og frekvens. Vi inkluderer også metoder for montering av apparatet og oppsett av eksperimentet på en måte som minimerer eksterne forstyrrelser.
Læring er vanligvis forbundet med et komplekst nervesystem, men det er økende bevis på at livet på alle nivåer, ned til enkeltceller, kan vise intelligent atferd. I både naturlige og kunstige systemer er læring den adaptive oppdateringen av systemparametere basert på ny informasjon, og intelligens er et mål på beregningsprosessen som letter læring. Stentor coeruleus er en encellet damboende organisme som utviser habituation, en form for læring der en atferdsrespons avtar etter en gjentatt stimulus. Stentor trekker seg sammen som svar på mekanisk stimulering, som er en tilsynelatende rømningsrespons fra akvatiske rovdyr. Imidlertid induserer gjentatte forstyrrelser med lav kraft tilvenning, demonstrert av en progressiv reduksjon i kontraksjonssannsynligheten. Her introduserer vi en metode for å kvantifisere Stentor habituation ved hjelp av et mikrokontrollerkortkoblet apparat som kan levere mekaniske pulser med en spesifisert kraft og frekvens, inkludert metoder for å bygge apparatet og sette opp eksperimentet på en måte som minimerer eksterne forstyrrelser. I motsetning til de tidligere beskrevne tilnærmingene for mekanisk stimulering av Stentor, tillater denne enheten at stimuleringskraften kan varieres under datastyring i løpet av et enkelt eksperiment, og øker dermed mangfoldet av inngangssekvenser som kan brukes. Å forstå habituation på nivået av en enkelt celle vil bidra til å karakterisere læringsparadigmer som er uavhengige av komplekse kretsløp.
Læring er vanligvis forbundet med et komplekst nervesystem, men det er økende bevis på at livet på alle nivåer, ned til enkeltceller, kan vise intelligent atferd. I både naturlige og kunstige systemer er læring den adaptive oppdateringen av systemparametere basert på ny informasjon1, og intelligens er et mål på beregningsprosessen som letter læring2.
Stentor coeruleus er en encellet damboende organisme som utviser habituation, en form for læring der en atferdsrespons avtar etter en gjentatt stimulus3. Stentor trekker seg sammen som svar på mekanisk stimulering3, som er en tilsynelatende rømningsrespons fra akvatiske rovdyr. Imidlertid induserer gjentatte forstyrrelser med lav kraft tilvenning, demonstrert ved en progressiv reduksjon i kontraksjonssannsynlighet3. Den tilvennede Stentor trekker seg fortsatt sammen etter å ha mottatt høykrafts mekanisk stimulering4 eller fotisk stimulering5. Disse observasjonene, som samsvarer med Thompson og Spencers klassiske kriterier for tilvenning hos dyr6, tyder sterkt på at den opprinnelige kontraktile responsreduksjonen skyldes læring i stedet for tretthet eller ATP-utmattelse. Som en frittlevende celle kan Stentor studeres uten mye interferens fra omkringliggende celler, slik tilfellet ville være i et flercellet vev. Flere tilleggsfunksjoner gjør Stentor til et trekkbart system for å studere læring: dens store størrelse (1 mm), dens kvantifiserbare tilvenningsrespons3, enkel injeksjon og mikromanipulering7, det fullt sekvenserte genomet8 og tilgjengeligheten av RNA-interferens (RNAi) verktøy9. Å bruke denne modellorganismen til å utforske cellelæring uten hjerne eller nervesystem krever en reproduserbar prosedyre for å stimulere Stentor-celler og måle responsen.
Her introduserer vi en metode for å kvantifisere Stentor habituation ved hjelp av et mikrokontrollerbrettkoblet apparat som kan levere mekaniske pulser med en spesifisert kraft og frekvens, inkludert metoder for å bygge apparatet og sette opp eksperimentet på en måte som minimerer eksterne forstyrrelser (figur 1). Å forstå habituation på nivået av en enkelt celle vil bidra til å karakterisere læringsparadigmer som er uavhengige av komplekse kretsløp.
Figur 1: Oppsett av tilvenningseksperiment. Petriplaten som inneholder Stentor er plassert på toppen av den fleksible metalllinjalen til tilvenningsanordningen. Armaturen til habituation-enheten treffer deretter metalllinjalen ved en spesifisert kraft og frekvens, og produserer en stimulusbølge over cellefeltet. USB-mikroskopkameraet registrerer Stentors respons på stimuleringen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Sammendrag av arbeidsflyten for tilvenningseksperimentet. Figuren viser de grunnleggende trinnene som er involvert i å studere Stentor ved hjelp av tilvenningsenheten. Figuren ble opprettet med BioRender.com. Tilpasset fra «Prosessflytskjema», av BioRender.com (2022). Hentet fra https://app.biorender.com/biorender-templates. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
De mest kritiske trinnene i protokollen er å sikre at Stentor forblir i optimale forhold for sammentrekninger. Kontraksjonsresponsen i tilvenningsanalysen krever at stentorer er forankret til en overflate ved hjelp av sin klissete holdfast, siden de sjelden trekker seg sammen når de svømmer fritt. Bunnflaten på 35 mm petriplaten som brukes til tilvenningseksperimenter bidrar imidlertid vanligvis ikke til forankring med mindre den er belagt med polyornitin. Videre kan Stentor ikke bli utsatt for mekanisk forstyrrelse i minst 2 timer før starten av tilvenningseksperimentet fordi Stentor glemmer tidsskalaen er 2-6 timer3. Hvis Stentor mottar mekanisk stimulering innen 2 timer etter tilvenningseksperimentets starttid, er det en mulighet for at denne tidligere stimuleringen vil indusere et lite nivå av tilvenning i forkant av forsøket, og dermed redusere kontraksjonssannsynligheten etter at tilvenningsanordningen leverer den første mekaniske pulsen. Til slutt, under analysefasen, er det viktig å bare telle antall Stentor som trekker seg sammen etter en puls – i stedet for tilfeldige spontane sammentrekninger som oppstår før pulsleveransen – for å oppnå en nøyaktig avlesning av brøkdelen av celler som kontraherte som svar på den mekaniske stimuleringen.
Protokollen kan lett modifiseres for å studere ulike typer tilvenningsdynamikk ved å endre kraften og frekvensen til de mekaniske pulser som leveres av tilvenningsanordningen. Dette gir også en mulighet til å utforske andre typer læring, for eksempel sensibilisering, som kan oppstå i Stentor. Selve mikrokontrollerkortprogramkoden kan også justeres for å levere forskjellige mønstre av mekaniske kraner til Stentor.
Et potensielt problem å feilsøke med denne protokollen er den lave frekvensen av Stentor-forankring , noe som kan begrense antall Stentor som kan observeres i habituation-eksperimentet. Forankringsfrekvensen reduseres noen ganger i Stentor-kulturer som ikke nylig har blitt matet eller er forurenset. For å løse dette problemet, bør man vaske en ny gruppe Stentor for å starte en ny kultur og mate dem regelmessig i henhold til protokollen beskrevet i Lin et al.10.
Denne protokollen er begrenset ved at bare en enkelt plate Stentor kan testes om gangen, noe som resulterer i relativt lave gjennomstrømningsmålinger. Videre tillater ikke nåværende programvare automatisering av enkeltcellet bildeanalyse. De fleste innhentede data er derfor på befolkningsnivå. Fremtidige modeller av habituation-enheten og bildeanalyseverktøyene kan legge til rette for enkeltcelleeksperimenter med høy gjennomstrømning.
Habituation i Stentor har tidligere blitt studert ved hjelp av metoder beskrevet av Wood3, men denne nye protokollen gjør det mulig å automatisere eksperimenter. Automatisering tillater ikke bare forskeren å reproduserbart levere mekaniske pulser av en spesifisert kraft og frekvens, men letter også langsiktige habituation eksperimenter siden enheten kan stå i gang uten tilsyn i flere dager. Videre reduserer bruk av en steppermotor i stedet for solenoiden som ble brukt i Woods eksperimenter3 risikoen for demagnetisering over tid og gjør det også mulig å variere styrken på stimulansen i løpet av et enkelt eksperiment.
Studier av cellulær tilvenning kan avsløre klinisk innsikt for tilstander som attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) og Tourettes syndrom der tilvenning er svekket11. Stentor habituation mekanismer kan også avdekke nye ikke-synaptiske læringsparadigmer uavhengig av komplekse cellulære kretser. Endelig kan innsikt om encellet læring inspirere metoder for omprogrammering av celler i flercellulært vev – en annen potensiell vei for å bekjempe sykdom.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Tatyana Makushok for utallige diskusjoner om Stentor læring. Dette arbeidet ble finansiert av NSF-stipend MCB- 2012647 og av NIH-stipend R35 GM130327, samt av I2CELL-prisen fra Stiftelsen Fourmentin-Guilbert.
0.01% Poly-ornithine | Millipore Sigma | P4957 | Used to coat Petri plate |
35-mm Petri plate | Benz Microscope Optics Center Inc. | L331 | Contains Stentor during experiments |
6-well plate | StemCell Technologies | 38016 | Used to wash Stentor |
Aluminum breadboard, 4" x 24" x 1/2" (x1) | Thorlabs | MB424 | Used to construct habituation device |
Big easy driver stepper motor driver board (x1) | Sparkfun | ROB-12859 | Used to construct habituation device |
Construction rail, 1" x 5'' (x2) | Newport | Newport CR-1 | Used to construct habituation device |
Laptop | Apple Store | https://www.apple.com/macbook-air-m1/ | Connect laptop to USB microscope to visualize experiments |
Large right-angle bracket (x1) | Thorlabs | AP90RL | Used to construct habituation device |
Microcontroller board | Arduino | A000066 | Used to control habituation device |
Nema 17 Stepper Motor Bipolar 59Ncm 2A 84oz.in 48mm 4-Lead | Stepperonline.com | 5-17HS19-2004S1 | Used to construct habituation device |
Pasteurized spring water | Carolina | 132458 | Media for Stentor experiments |
Right-angle bracket (x3) | Thorlabs | AP90 | Used to construct habituation device |
Stemi 2000 stereo microscope | Zeiss | Used to visualize Stentor during wash steps | |
Stentor coeruleus | Carolina | 131598 | These are the cells used for habituation experiments |
USB microscope | Celestron | 44308 | Used to visualize and record experiments |
Webcam recorder | Apple Store | https://apps.apple.com/us/app/webcam-recorder/id1508067444?mt=12 | Install this application to take videos of experiments |