Vi introducerar en metod för att kvantifiera Stentor-tillvänjning med hjälp av en mikrokontroller-kortlänkad apparat som kan leverera mekaniska pulser vid en viss kraft och frekvens. Vi inkluderar också metoder för att montera apparaten och ställa in experimentet på ett sätt som minimerar yttre störningar.
Lärande är vanligtvis förknippat med ett komplext nervsystem, men det finns ökande bevis för att livet på alla nivåer, ner till enskilda celler, kan visa intelligenta beteenden. I både naturliga och artificiella system är lärande den adaptiva uppdateringen av systemparametrar baserat på ny information, och intelligens är ett mått på beräkningsprocessen som underlättar lärandet. Stentor coeruleus är en encellig dammboende organism som uppvisar tillvänjning, en form av inlärning där ett beteendemässigt svar minskar efter en upprepad stimulans. Stentor kontraherar som svar på mekanisk stimulering, vilket är ett uppenbart flyktsvar från vattenlevande rovdjur. Upprepade störningar med låg kraft inducerar emellertid tillvänjning, vilket demonstreras av en progressiv minskning av kontraktionssannolikheten. Här introducerar vi en metod för att kvantifiera Stentor-tillvänjning med hjälp av en mikrokontroller-kortlänkad apparat som kan leverera mekaniska pulser vid en viss kraft och frekvens, inklusive metoder för att bygga apparaten och ställa in experimentet på ett sätt som minimerar yttre störningar. I motsats till de tidigare beskrivna tillvägagångssätten för mekaniskt stimulerande Stentor, tillåter denna anordning att stimuleringskraften varieras under datorkontroll under ett enda experiment, vilket kraftigt ökar de olika ingångssekvenserna som kan appliceras. Att förstå tillvänjning på nivå med en enda cell hjälper till att karakterisera inlärningsparadigmer som är oberoende av komplexa kretsar.
Lärande är vanligtvis förknippat med ett komplext nervsystem, men det finns ökande bevis för att livet på alla nivåer, ner till enskilda celler, kan visa intelligenta beteenden. I både naturliga och artificiella system är lärande den adaptiva uppdateringen av systemparametrar baserat på ny information1, och intelligens är ett mått på beräkningsprocessen som underlättar inlärning2.
Stentor coeruleus är en encellig dammboende organism som uppvisar tillvänjning, en form av inlärning där ett beteendemässigt svar minskar efter en upprepad stimulans3. Stentor kontraherar som svar på mekanisk stimulering3, vilket är ett uppenbart flyktsvar från vattenlevande rovdjur. Upprepade störningar med låg kraft inducerar emellertid tillvänjning, vilket demonstreras av en progressiv minskning av sammandragningssannolikheten3. Den vana Stentor drar sig fortfarande samman efter att ha fått mekanisk stimulering med hög kraft4 eller fotisk stimulering5. Dessa observationer, som överensstämmer med Thompson och Spencers klassiska kriterier för tillvänjning hos djur6, tyder starkt på att den ursprungliga kontraktila svarsminskningen beror på inlärning snarare än trötthet eller ATP-utarmning. Som en fritt levande cell kan Stentor studeras utan mycket störningar från omgivande celler, vilket skulle vara fallet i en multicellulär vävnad. Flera ytterligare funktioner gör Stentor till ett lätthanterligt system för att studera inlärning: dess stora storlek (1 mm), dess kvantifierbara tillvänjningssvar3, enkel injektion och mikromanipulering7, det helt sekvenserade genomet8 och tillgängligheten av RNA-interferens (RNAi) verktyg9. Att använda denna modellorganism för att utforska cellinlärning utan hjärna eller nervsystem kräver en reproducerbar procedur för att stimulera Stantor-celler och mäta svaret.
Här introducerar vi en metod för att kvantifiera Stentor-tillvänjning med hjälp av en mikrokontroller-kortlänkad apparat som kan leverera mekaniska pulser vid en viss kraft och frekvens, inklusive metoder för att bygga apparaten och ställa in experimentet på ett sätt som minimerar yttre störningar (figur 1). Att förstå tillvänjning på nivå med en enda cell hjälper till att karakterisera inlärningsparadigmer som är oberoende av komplexa kretsar.
Bild 1: Inställning av tillvänjningsexperiment. Petriplattan som innehåller Stentor placeras ovanpå den flexibla metalllinjalen på tillvänjningsanordningen. Ankaret på tillvänjningsanordningen träffar sedan metalllinjalen vid en viss kraft och frekvens, vilket ger en stimulansvåg över cellfältet. USB-mikroskopkameran registrerar Stentors svar på stimuleringen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Sammanfattning av arbetsflödet för tillvänjningsexperimentet. Figuren visar de grundläggande stegen som är involverade i att studera Stentor med hjälp av tillvänjningsanordningen. Figuren skapades med BioRender.com. Anpassad från “Process Flowchart”, av BioRender.com (2022). Hämtad från https://app.biorender.com/biorender-templates. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
De mest kritiska stegen i protokollet avser att säkerställa att Stentor förblir i optimala förhållanden för att sammandragningar ska inträffa. Sammandragningssvaret i tillvänjningsanalysen kräver att stentorer är förankrade i en yta med hjälp av sin klibbiga hållfasthet eftersom de sällan drar ihop sig när de simmar fritt. Bottenytan på den 35 mm petriplatta som används för tillvänjningsexperiment bidrar dock vanligtvis inte till förankring om den inte är belagd med polyornitin. Dessutom kan Stentor inte utsättas för någon mekanisk störning i minst 2 timmar före tillvänjningsexperimentets början eftersom Stentor-glömskans tidsskala är 2-6 h3. Om Stentor får mekanisk stimulering inom 2 timmar efter tillvänjningsexperimentets starttid, finns det en möjlighet att denna tidigare stimulering kommer att inducera en liten nivå av tillvänjning före experimentet, vilket minskar sammandragningssannolikheten efter att tillvänjningsanordningen levererar den första mekaniska pulsen. Slutligen, under analyssteget, är det viktigt att bara räkna antalet Stentor som dras samman efter en puls – snarare än några tillfälliga spontana sammandragningar som inträffar före pulsleveransen – för att få en korrekt avläsning av den fraktion av celler som drog ihop sig som svar på den mekaniska stimuleringen.
Protokollet kan lätt modifieras för att studera olika typer av tillvänjningsdynamik genom att ändra kraften och frekvensen hos de mekaniska pulser som levereras av tillvänjningsanordningen. Detta ger också en möjlighet att utforska andra typer av lärande, såsom sensibilisering, som kan uppstå i Stentor. Själva programkoden för mikrokontrollerkortet kan också justeras för att leverera olika mönster av mekaniska kranar till Stentor.
Ett potentiellt problem att felsöka med detta protokoll är den låga frekvensen av Stentor-förankring , vilket kan begränsa antalet Stentor som kan observeras i tillvänjningsexperimentet. Förankringsfrekvensen reduceras ibland i Stentor-kulturer som inte nyligen har matats eller är förorenade. För att lösa detta problem bör man tvätta en ny sats Stentor för att starta en ny kultur och mata dem regelbundet enligt protokollet som beskrivs i Lin et al.10.
Detta protokoll är begränsat genom att endast en enda platta av Stentor kan testas åt gången, vilket resulterar i relativt låga genomströmningsmätningar. Dessutom tillåter nuvarande programvara inte automatisering av encellsbildanalys. De flesta uppgifter som inhämtas är därför på befolkningsnivå. Framtida modeller av tillvänjningsanordningen och bildanalysverktyg kan underlätta encellsexperiment med hög genomströmning.
Tillvänjning i Stentor har tidigare studerats med metoder som beskrivs av Wood3, men detta nya protokoll gör det möjligt att automatisera experiment. Automatisering gör det inte bara möjligt för forskaren att reproducerbart leverera mekaniska pulser med en viss kraft och frekvens utan underlättar också långsiktiga tillvänjningsexperiment eftersom enheten kan lämnas igång utan övervakning i flera dagar. Att använda en stegmotor snarare än solenoiden som används i Woods experiment3 minskar dessutom risken för avmagnetisering över tid och gör det också möjligt att variera stimulansens styrka under ett enda experiment.
Att studera cellulär tillvänjning kan avslöja kliniska insikter för tillstånd som uppmärksamhetsunderskott / hyperaktivitetsstörning (ADHD) och Tourettes syndrom där tillvänjningen är nedsatt11. Stentors tillvänjningsmekanismer kan också avslöja nya icke-synaptiska inlärningsparadigmer oberoende av komplexa cellulära kretsar. Slutligen kan insikter om encellsinlärning inspirera metoder för omprogrammering av celler i flercelliga vävnader – en annan potentiell väg att bekämpa sjukdomar.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Tatyana Makushok för otaliga diskussioner om Stentor-lärande . Detta arbete finansierades av NSF-bidrag MCB- 2012647 och av NIH-bidrag R35 GM130327, samt av I2CELL-utmärkelsen från Foundation Fourmentin-Guilbert.
0.01% Poly-ornithine | Millipore Sigma | P4957 | Used to coat Petri plate |
35-mm Petri plate | Benz Microscope Optics Center Inc. | L331 | Contains Stentor during experiments |
6-well plate | StemCell Technologies | 38016 | Used to wash Stentor |
Aluminum breadboard, 4" x 24" x 1/2" (x1) | Thorlabs | MB424 | Used to construct habituation device |
Big easy driver stepper motor driver board (x1) | Sparkfun | ROB-12859 | Used to construct habituation device |
Construction rail, 1" x 5'' (x2) | Newport | Newport CR-1 | Used to construct habituation device |
Laptop | Apple Store | https://www.apple.com/macbook-air-m1/ | Connect laptop to USB microscope to visualize experiments |
Large right-angle bracket (x1) | Thorlabs | AP90RL | Used to construct habituation device |
Microcontroller board | Arduino | A000066 | Used to control habituation device |
Nema 17 Stepper Motor Bipolar 59Ncm 2A 84oz.in 48mm 4-Lead | Stepperonline.com | 5-17HS19-2004S1 | Used to construct habituation device |
Pasteurized spring water | Carolina | 132458 | Media for Stentor experiments |
Right-angle bracket (x3) | Thorlabs | AP90 | Used to construct habituation device |
Stemi 2000 stereo microscope | Zeiss | Used to visualize Stentor during wash steps | |
Stentor coeruleus | Carolina | 131598 | These are the cells used for habituation experiments |
USB microscope | Celestron | 44308 | Used to visualize and record experiments |
Webcam recorder | Apple Store | https://apps.apple.com/us/app/webcam-recorder/id1508067444?mt=12 | Install this application to take videos of experiments |