Hier presenteren we een protocol om aanhangende cellen uit meerlaagse kolven op een gesloten semi-geautomatiseerde manier te oogsten met behulp van een tegenstroomcentrifugatiesysteem. Dit protocol kan worden toegepast voor het oogsten van zowel adherente als suspensiecellen van andere celexpansieplatforms met weinig aanpassingen aan de bestaande stappen.
Menselijke mesenchymale stamcellen (hMSCs) worden momenteel onderzocht als een veelbelovende op cellen gebaseerde therapeutische modaliteit voor verschillende ziekten, met meer marktgoedkeuringen voor klinisch gebruik verwacht in de komende jaren. Om deze overgang te vergemakkelijken, is het van cruciaal belang om de knelpunten op het gebied van schaal, batch-to-lot reproduceerbaarheid, kosten, naleving van regelgeving en kwaliteitscontrole aan te pakken. Deze uitdagingen kunnen worden aangepakt door het proces af te sluiten en geautomatiseerde productieplatforms te gebruiken. In deze studie ontwikkelden we een gesloten en semi-geautomatiseerd proces voor het passeren en oogsten van Wharton’s jelly (WJ)-afgeleide hMSCs (WJ-hMSCs) uit meerlaagse kolven met behulp van tegenstroomcentrifugatie. De WJ-hMSCs werden uitgebreid met behulp van regelgevingsconform serumvrij xenovrij (SFM XF) medium, en ze toonden vergelijkbare celproliferatie (populatieverdubbeling) en morfologie als WJ-hMSCs uitgebreid in klassieke serumbevattende media. Ons gesloten semi-geautomatiseerde oogstprotocol toonde een hoog celherstel (~ 98%) en levensvatbaarheid (~ 99%). De cellen gewassen en geconcentreerd met behulp van tegenstroomcentrifugatie handhaafden WJ-hMSC-oppervlaktemarkerexpressie, kolonievormende eenheden (CFU-F), trilineagedifferentiatiepotentiaal en cytokinesecretieprofielen. Het semi-geautomatiseerde celoogstprotocol dat in de studie is ontwikkeld, kan eenvoudig worden toegepast voor de kleinschalige tot middelgrote verwerking van verschillende hechtende en suspensiecellen door rechtstreeks verbinding te maken met verschillende celexpansieplatforms om volumereductie, wassen en oogsten uit te voeren met een laag uitgangsvolume.
Menselijke mesenchymale stamcellen (hMSCs) zijn een geweldige kandidaat voor klinische toepassingen, zowel in tissue engineering als in celtherapieën, gezien hun therapeutisch potentieel en hoge zelfvernieuwingspotentieel om in vitro te groeien, die van cruciaal belang zijn voor het genereren van klinisch relevante doseringen van cellen 1,2,3. Volgens ClinicalTrials.gov zijn er momenteel meer dan 1.000 klinische onderzoeken in onderzoek voor verschillende aandoeningen4. Gezien de toenemende belangstelling voor het gebruik van hMSC’s, zijn er in de nabije toekomst meer klinische onderzoeken en marktgoedkeuringen op handen 5,6. De productie van hMSCs heeft echter veel inherente uitdagingen in termen van batch-to-batch variabiliteit, het gebruik van risicovolle grondstoffen, zorgen over verontreiniging als gevolg van vele open en handmatige processen, omdat de productie meerdere eenheidsbewerkingen omvat, hogere arbeidskosten, de kosten van opschalen of opschalen, en regelgevende hindernissen 6,7,8,9,10, 11,12. Deze kwesties blijven een belangrijke belemmering voor de huidige en toekomstige markttoegang.
De ontwikkeling van gesloten, modulaire, geautomatiseerde productieoplossingen en het gebruik van hulpreagentia met een laag risico zouden deze uitdagingen aanpakken. Dit zou ook zorgen voor een consistente productkwaliteit, de kans op batchfouten als gevolg van menselijke fouten verminderen, de arbeidskosten verlagen en de processtandaardisatie en naleving van de regelgeving verbeteren, zoals in termen van digitale batchregistratie 8,12,13,14. Om een klinisch relevante dosering van cellen te kunnen verkrijgen, of het nu gaat om autologe of allogene, gestroomlijnde productie waarbij upstream celexpansie en downstream verwerking op een gesloten, geautomatiseerde manier plaatsvindt, is cruciaal.
Voor upstream hMSC-uitbreiding zijn de twee meest gebruikte productiemethoden momenteel scale-out (2D-monolaag) en opschaling (3D-microcarrier-gebaseerd ophangsysteem)15,16,17,18. De meest traditionele en meest gebruikte methode voor hMSC-uitbreiding is 2D-monolayer-gebaseerde cultuur vanwege de lage productiekosten en het gemak van installatie19.
Meerlaagse kolven bestaande uit trays met een plat oppervlak die in een kweekvat zijn gestapeld, worden vaak gebruikt om de hMSC-productie op te schalen. Deze systemen worden meestal geleverd in 1-laags tot 40-laags kweekvaten20 en worden handmatig behandeld in bioveiligheidskasten. De verwerkingsstappen tijdens het passeren en oogsten van cellen omvatten het handmatig doseren en decanteren van de expansiemedia, dissociatiereagens en wasbuffer door pipetteren of fysiek kantelen van het hele vat. Bovendien is het hanteren van meerdere eenheden uitdagend en tijdrovend vanwege hun enorme omvang en gewicht.
Vervolgens zijn naoogsten uit meerlaagse kolven, centrifugeren voor media-uitwisseling, celwassen en volumereductie essentiële stappen in de gehele celproductieworkflow21. Conventionele benchtopcentrifugatie is een meestal open en handmatig proces dat een groot aantal stappen omvat, zoals het overbrengen van de celsuspensie in afgedekte buizen of flessen in een bioveiligheidskast, het draaien van de cellen, het handmatig aanzuigen van het supernatant, celresuspensie met de buffer en herhaalde celwasbeurten. Dit verhoogt zowel het risico op besmetting door het openen en sluiten van de doppen als de kans op verlies van de celpellet tijdens het handmatige aspiratie- / pipetteerprocesdrastisch 22. In de context van het hanteren van meerlaagse kweeksystemen voor op aanhang gebaseerde cellen zoals hMSC’s, zou de operator een moeizaam proces moeten doorlopen van herhaaldelijk pendelen tussen de centrifuge en de bioveiligheidskast en tegelijkertijd het hanteren van een zware eenheid. Deze handmatige stappen zijn arbeidsintensief, brengen risico’s met zich mee in termen van menselijke fouten en verontreiniging en moeten worden uitgevoerd in een klasse B cleanroom-omgeving, wat kostbaar is23. Bovendien is het conventionele handmatige centrifugeerproces niet schaalbaar en kan het cellulaire afschuiving en spanning veroorzaken; Het maximaliseren van celherstel, levensvatbaarheid en de uitspoelefficiëntie van resterende onzuiverheden zijn dus andere grote uitdagingen22. Commerciële cGMP-schaalproductie van celtherapieën vereist gesloten, modulaire automatiseringsoplossingen om het risico op besmetting te verminderen, een consistente productkwaliteit te garanderen, arbeids- en productiekosten te verlagen en de procesbetrouwbaarheid te verhogen24,25. Meerlaagse kolven kunnen als een gesloten systeem worden behandeld door een steriel filter van 0,2 μm in een van de poorten te hebben om steriele gasuitwisseling te vergemakkelijken en een tweede poort aseptisch verbonden via connectoren of buisgelast rechtstreeks op een geautomatiseerd celverwerkingsinstrument voor celoogst. We hebben gewerkt aan het sluiten en automatiseren van de meeste stappen van WJ-hMSC passaging en harvesting door een innovatieve gesloten tegenstroomcentrifuge te evalueren die bedoeld is voor de productie van cel-, gen- of weefselgebaseerde producten. Deze tegenstroomcentrifuge heeft ook de flexibiliteit om een verscheidenheid aan celverwerkingstoepassingen uit te voeren, zoals celscheiding op basis van grootte, medium / bufferuitwisseling, concentratie en oogsten voor een verscheidenheid aan celtypen 8,26,27,28. Het instrument maakt gebruik van een gesloten kit voor eenmalig gebruik die steriel kan worden aangesloten met behulp van buislassen of aseptische connectoren om zakken over te brengen of rechtstreeks kan worden aangesloten op elk uitbreidingsplatform naar keuze.
In deze studie hebben we een aangepaste buisassemblage ontworpen om gesloten steriele verbindingen mogelijk te maken tussen de tegenstroomcentrifugatiekit voor eenmalig gebruik en de meerlaagse kolf. We hebben een protocol geoptimaliseerd om WJ-MSC’s enzymatisch los te maken, te wassen en te oogsten van de meerlaagse kolf op een volledig gesloten en semi-geautomatiseerde manier binnen één run. De geoogste WJ-hMSCs werden gekarakteriseerd voor zuiverheid (oppervlaktemarkeranalyse) en potentie (CFU-F, trilineagedifferentiatie en cytokinesecretieprofielen) om ervoor te zorgen dat het eindproduct voldeed aan de kritische kwaliteitskenmerken (CQAs) voor partijvrijgave.
In dit werk hebben we de mogelijkheid getoond om hMSC-dissociatie te sluiten en semi-automatiseren en op de bank te wassen en te oogsten met behulp van een tegenstroomcentrifugatie-instrument. Een van de kritieke stappen in de hele workflow is ervoor te zorgen dat de buizen zijn aangesloten volgens het vooraf ingestelde protocol dat is gedefinieerd in de protocolbouwer van het tegenstroomcentrifugatiesysteem. De installatie en bediening zijn eenvoudig en de tijd die nodig was om ongeveer 2 L cultuur van een 10-laags kolf van kitassemblage tot celoogst te verwerken, was ongeveer 60 minuten. Een van de beperkende stappen in deze workflow is de vloeistofoverdracht van de meerlaagse kolf naar de transferzakken die zijn aangesloten op het tegenstroomcentrifugatie-instrument. De high-flow single-use kit kan alleen worden uitgevoerd met een maximaal debiet van 165 ml / min, en dit kan een uitdaging zijn voor het verwerken van bijvoorbeeld een 40-laags kolf. Om het proces van vloeistofoverdracht te versnellen, kunnen externe pompen met een hoog debiet worden gebruikt om de trypsine-inhoud eerst in een transferzak over te brengen, gevolgd door het wassen / concentreren en oogsten van de cellen uit de transferzak met behulp van het tegenstroomcentrifugatiesysteem. Bovendien kan dit protocol ook worden toegepast voor passerende cellen van 4-laags tot 10-laags meerlaagse kolven. Verder stroomopwaarts kan het tegenstroomcentrifugatiesysteem ook worden geoptimaliseerd voor het wassen van ontdooide hMSC’s en directe oogst en mediumformulering in meerlaagse kolven om de zaadtrein te starten. Opgemerkt moet worden dat het minimale aantal cellen dat nodig is om het wervelbed in de tegenstroomcentrifugeerkamer te vormen ongeveer 30 miljoen cellen is en dat het maximale aanbevolen volume om per batch te verwerken 20 l is.
Momenteel zijn de bevestiging van de aangepaste buisassemblage aan de meerlaagse kolf in de bioveiligheidskast en het autoclaveren van de delen van de componenten niet wenselijk in een cGMP-omgeving. Als alternatief kan een aangepaste gamma-gesteriliseerde buisassemblage worden uitbesteed aan leveranciers. Leveranciers die meerlaagse kolven leveren, bieden ook de mogelijkheid om de kolven vooraf te voorzien van gewenste buisassemblages, inclusief een filter van 0,2 μm, en gammasterilisatie van de hele outfit. Dit zou ervoor zorgen dat de meerlaagse kolven en de bevestigde buizen echt gesloten zijn, wat betekent dat het proces op de bank in een klasse C cleanroom-omgeving kan worden voltooid.
Dit proces met behulp van het tegenstroomcentrifugatiesysteem is niet beperkt tot op adherent gebaseerde gekweekte cellen in een meerlagig vat en kan worden aangepast aan dynamische (geroerde tank of golfbioreactoren) en statische (gasdoorlatende) op suspensie gebaseerde celexpansieplatforms. Specifiek voor hMSC’s die zijn uitgebreid in 3D-microdragerculturen, kunnen protocollen worden geoptimaliseerd op het tegenstroomcentrifugatiesysteem om de hMSC’s die zijn losgekoppeld van microdragers te oogsten, te wassen en te formuleren.
Over het algemeen heeft de toenemende interesse in het ontwikkelen van translationele cellulaire therapieën met verbeterde procesrobuustheid en betrouwbaarheid geleid tot de ontwikkeling van gesloten, geautomatiseerde celverwerkingsplatforms. Deze systemen zijn absoluut noodzakelijk, omdat ze het aantal handelingsstappen verminderen, mogelijke besmetting door steriele verbindingen voorkomen en de productiekosten verlagen door arbeid te verminderen en het effectieve gebruik van cleanroomruimtete verbeteren 21. In lijn hiermee zijn veel van de productontwikkelaars voor celtherapie die wettelijke goedkeuring zoeken om hun therapieën te vertalen, zich bewust van het belang van het sluiten van het proces en het implementeren van volledige automatisering of semi-automatisering al in de procesontwikkelingsfase 14,31,32.
Met het gebruik van regelgevingsvriendelijk SFM XF-medium en samen met aanvullende reagentia die voldoen aan 21 CFR GMP Part 11 en internationale kwaliteitsrichtlijnen, zou dit semi-geautomatiseerde proces gemakkelijk geschikt zijn voor klinische productie. We hebben de reproduceerbaarheid van het gesloten proces en het behoud van de kwaliteit van de WJ-MSC’s aangetoond. Het verbeteren van de efficiëntie en veiligheid van het kweken van op aanhang gebaseerde cellen in meerlaagse kolven zou niet alleen het hMSC-therapieveld ten goede komen, maar ook bedrijven in cellijnbankieren en de productie van adherente virussen.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag de steun erkennen van de Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) financiering (H18/01/a0/021 en H18/AH/a0/001) van A*STAR, Singapore.
2L PVC transfer bag | TerumoBCT | BB*B200TM | |
Alcian blue solution, pH 2.5 | Merck | 101647 | |
Alizarin-Red Staining Solution | Merck | TMS-008-C | |
APC anti-human CD73 Antibody | Biolegend | 344015 | |
APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | Biolegend | 400121 | |
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader | Bio-Rad | ||
Counterflow Centrifugation System | Thermo Fisher Scientific | A47679 | Gibco CTS Rotea Counterflow Centrifugation System |
Crystal Violet | Sigma-aldrich | C0775 | |
CTS (L-alanyl-L-glutamine) GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
CTS Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | A1285601 | no calcium, no magnesium |
CTS Recombinant Human Vitronectin (VTN-N) | Thermo Fisher Scientific | A27940 | |
CTS TrypLE Select Enzyme | Thermo Fisher Scientific | A1285901 | |
Custom tubing assembly | Saint-Gobain and Colder Product Company (CPC) | N/A | Gamma-sterilized 3/32” ID PVC line fitted with a sterile male MPC (1/8” barb) and sealed on the other end. Autoclave a short C-Flex line fitted with a sterile Cell Factory port connector on one end and a female MPC (3/8” barb) on the other. Connect the PVC and C-Flex lines in a biosafety cabinet |
Emflon II capsule (0.2um filter) | Pall | KM5V002P2G100 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12662029 | Mesenchymal stem cell-qualified, USDA-approved regions |
FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | |
FITC anti-human CD105 Antibody | Biolegend | 323203 | |
FITC anti-human CD45 Antibody | Biolegend | 304005 | |
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody | Biolegend | 328107 | |
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | Biolegend | 400109 | |
Hi-Flow Single Use Kit | Thermo Fisher Scientific | A46575 | Gibco CTS Rotea Hi-flow single-use kit, flow rate of 30 – 165 mL/min |
Multi-layered systems | Thermo Fisher Scientific | 140360 (4-layers); 140410 (10-layers) | Nunc Standard Cell Factory Systems |
NucleoCounter NC-3000 | Chemometec | NC-3000 | |
Oil red O staining solution | Merck | 102419 | |
PDGF-BB | Thermo Fisher Scientific | PHG0045 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
PerCP anti-human CD34 Antibody | Biolegend | 343519 | |
PerCP Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody | Biolegend | 400147 | |
ProcartaPlex Multiplex Immunoassays | Thermo Fisher Scientific | Custom 19-Plex panel: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2 , MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, PDGF-BB, RANTES, SDF-1α, TGFα, TNF-alpha, VEGF-A | |
Sample port | Thermo Fisher Scientific | A50111 | Gamma-sterilized leur sample port with 2 PVC lines attached |
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher Scientific | A10070-01 | |
StemPro Chondrocyte Differentiation | Thermo Fisher Scientific | A10071-01 | |
StemPro Custom MSC SF XF Medium Kit (SFM XF medium) | Thermo Fisher Scientific | ME20236L1 | Contains StemPro MSC SFM Basal Medium and Custom MSC SF XF Supplement (100x) |
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher Scientific | A10072-01 | |
T175 Nunc EasYFlask | Thermo Fisher Scientific | 159910 | |
T75 Nunc EasYFlask | Thermo Fisher Scientific | 156472 | |
TGFβ1 | Thermo Fisher Scientific | PHG9204 | |
WJ MSCs | PromoCell | (#C12971; Germany) | Human mesenchymal stem cells |
αMEM media | Thermo Fisher Scientific | 12571063 | With nucleosides |