Aquí, presentamos un protocolo para cosechar células adherentes de matraces multicapa de manera semiautomatizada cerrada utilizando un sistema de centrifugación de contraflujo. Este protocolo se puede aplicar para recolectar células adherentes y de suspensión de otras plataformas de expansión celular con pocas modificaciones a los pasos existentes.
Las células madre mesenquimales humanas (hMSC) se están explorando actualmente como una modalidad terapéutica prometedora basada en células para diversas enfermedades, y se esperan más aprobaciones de mercado para uso clínico en los próximos años. Para facilitar esta transición, es fundamental abordar los cuellos de botella de la escala, la reproducibilidad de lote a lote, el costo, el cumplimiento normativo y el control de calidad. Estos desafíos se pueden abordar cerrando el proceso y adoptando plataformas de fabricación automatizadas. En este estudio, desarrollamos un proceso cerrado y semiautomatizado para el paso y la recolección de hMSC derivadas de la jalea de Wharton (WJ) (WJ-hMSC) de matraces de varias capas mediante centrifugación de contraflujo. Las WJ-hMSC se expandieron utilizando un medio libre de xeno-sin suero (SFM XF) que cumple con las regulaciones, y mostraron una proliferación celular (duplicación de la población) y morfología comparables a las WJ-hMSC expandidas en medios clásicos que contienen suero. Nuestro protocolo cerrado de recolección semiautomatizada demostró una alta recuperación celular (~ 98%) y viabilidad (~ 99%). Las células lavadas y concentradas mediante centrifugación de contraflujo mantuvieron la expresión del marcador de superficie WJ-hMSC, las unidades formadoras de colonias (UFC-F), el potencial de diferenciación de trilinaje y los perfiles de secreción de citoquinas. El protocolo de recolección celular semiautomatizado desarrollado en el estudio se puede aplicar fácilmente para el procesamiento a pequeña y mediana escala de varias células adherentes y de suspensión conectándose directamente a diferentes plataformas de expansión celular para realizar la reducción de volumen, lavado y recolección con un bajo volumen de salida.
Las células madre mesenquimales humanas (hMSCs) son un gran candidato para aplicaciones clínicas, tanto en ingeniería tisular como en terapias celulares, dado su potencial terapéutico y su alto potencial de autorrenovación para crecer in vitro, que son críticos para generar dosis clínicamente relevantes de células 1,2,3. Según ClinicalTrials.gov, hay más de 1.000 ensayos clínicos actualmente bajo investigación para diversas enfermedades4. Dado el telón de fondo del creciente interés en el uso de hMSCs, más ensayos clínicos y aprobaciones de mercado son inminentes en un futuro próximo 5,6. Sin embargo, la fabricación de hMSC tiene muchos desafíos inherentes en términos de variabilidad de lote a lote, el uso de materias primas de alto riesgo, preocupaciones con respecto a la contaminación debido a muchos procesos abiertos y manuales, ya que la fabricación implica múltiples operaciones unitarias, mayores costos de mano de obra, el costo de escalar o ampliar y obstáculos regulatorios 6,7,8,9,10, 11,12. Estas cuestiones siguen siendo un obstáculo importante para el acceso actual y futuro a los mercados.
El desarrollo de soluciones de fabricación cerradas, modulares y automatizadas y el uso de reactivos auxiliares de bajo riesgo abordarían estos desafíos. Esto también garantizaría una calidad constante del producto, disminuiría la probabilidad de fallas de lotes debido a errores humanos, reduciría los costos de mano de obra y mejoraría la estandarización del proceso y el cumplimiento normativo, como en términos de mantenimiento de registros digitales de lotes 8,12,13,14. Para poder obtener una dosis clínicamente relevante de células, ya sea autóloga o alogénica, es crucial una fabricación simplificada que implique la expansión celular ascendente y el procesamiento posterior de manera cerrada y automatizada.
Para la expansión hMSC aguas arriba, los dos métodos de fabricación más comunes empleados actualmente son el escalamiento horizontal (monocapa 2D) y el escalado vertical (sistema de suspensión basado en microportadores 3D)15,16,17,18. El método más tradicional y ampliamente adoptado para la expansión de hMSC es el cultivo monocapa 2D debido al bajo costo de producción y la facilidad de configuración19.
Los matraces multicapa compuestos de bandejas de superficie plana apiladas dentro de un recipiente de cultivo se utilizan comúnmente para escalar la producción de hMSC. Estos sistemas generalmente vienen en recipientes de cultivo de 1 capa a 40 capas20 y se manejan manualmente dentro de los gabinetes de bioseguridad. Los pasos de procesamiento durante el paso y la recolección de células implican la dispensación y decantación manual de los medios de expansión, el reactivo de disociación y el tampón de lavado mediante pipeteo o inclinación física de todo el recipiente. Además, manejar múltiples unidades es desafiante y requiere mucho tiempo debido a su gran tamaño y peso.
Posteriormente, la poscosecha de matraces multicapa, la centrifugación para el intercambio de medios, el lavado celular y la reducción de volumen son pasos esenciales en todo el flujo de trabajo de fabricación de células21. La centrifugación convencional de sobremesa es un proceso mayormente abierto y manual que implica una multitud de pasos, como transferir la suspensión celular a tubos o botellas tapados dentro de un gabinete de bioseguridad, girar las células, aspirar manualmente el sobrenadante, resuspensión celular con el tampón y lavados celulares repetidos. Esto aumenta dramáticamente tanto el riesgo de contaminación debido a la apertura y cierre de las tapas como las posibilidades de perder el pellet de la celda durante el proceso manual de aspiración/pipeteo22. En el contexto del manejo de sistemas de cultivo multicapa para células basadas en adherentes, como las hMSC, el operador tendría que pasar por un laborioso proceso de transporte entre la centrífuga y el gabinete de bioseguridad repetidamente y manejar una unidad pesada al mismo tiempo. Estos pasos manuales son laboriosos, plantean riesgos en términos de errores humanos y contaminación, y deben llevarse a cabo en un entorno de sala limpia de Clase B, que es costoso23. Además, el proceso de centrifugación manual convencional no es escalable y podría causar cizallamiento celular y estrés; Por lo tanto, maximizar la recuperación celular, la viabilidad y la eficiencia de lavado de las impurezas residuales son otros desafíos importantes22. La fabricación comercial a escala cGMP de terapias celulares requiere soluciones de automatización cerradas y modulares para reducir el riesgo de contaminación, garantizar una calidad constante del producto, reducir los costos de mano de obra y producción, y aumentar la confiabilidad del proceso24,25. Los matraces multicapa se pueden manejar como un sistema cerrado al tener un filtro estéril de 0,2 μm en uno de los puertos para facilitar el intercambio de gases estériles y un segundo puerto conectado asépticamente a través de conectores o soldado por tubo directamente a un instrumento automatizado de procesamiento celular para la recolección de células. Trabajamos para cerrar y automatizar la mayoría de los pasos de paso y cosecha de WJ-hMSC mediante la evaluación de una innovadora centrífuga de contraflujo cerrado destinada a la fabricación de productos basados en células, genes o tejidos. Esta centrífuga de contraflujo también tiene la flexibilidad de realizar una variedad de aplicaciones de procesamiento celular, como la separación celular basada en el tamaño, el intercambio medio/tampón, la concentración y la recolección para una variedad de tipos de células 8,26,27,28. El instrumento utiliza un kit cerrado de un solo uso que se puede conectar estéril mediante soldadura de tubos o conectores asépticos para transferir bolsas o se puede conectar directamente a cualquier plataforma de expansión de su elección.
En este estudio, diseñamos un conjunto de tubos personalizado para permitir conexiones estériles cerradas entre el kit de centrifugación de contraflujo de un solo uso y el matraz multicapa. Optimizamos un protocolo para separar, lavar y cosechar enzimáticamente WJ-MSC del matraz multicapa de una manera completamente cerrada y semiautomatizada en una sola ejecución. Las WJ-hMSC cosechadas se caracterizaron por su pureza (análisis de marcadores de superficie) y potencia (UFC-F, diferenciación trilinaje y perfiles de secreción de citoquinas) para garantizar que el producto final cumpliera con los atributos críticos de calidad (CQA) para la liberación del lote.
En este trabajo, hemos demostrado la capacidad de cerrar y semiautomatizar la disociación de hMSC y lavar y cosechar en el banco utilizando un instrumento de centrifugación de contraflujo. Uno de los pasos críticos en todo el flujo de trabajo es asegurarse de que los tubos estén conectados de acuerdo con el protocolo preestablecido definido en el generador de protocolos del sistema de centrifugación de contraflujo. La configuración y el funcionamiento son sencillos, y el tiempo necesario para procesar alrededor de 2 L de cultivo desde un matraz de 10 capas desde el montaje del kit hasta la cosecha de células fue de unos 60 minutos. Uno de los pasos limitantes en este flujo de trabajo es la transferencia de fluido desde el matraz multicapa a las bolsas de transferencia conectadas al instrumento de centrifugación de contraflujo. El kit de un solo uso de alto caudal solo puede funcionar a un caudal máximo de 165 ml/min, y esto podría ser un reto para el procesamiento, por ejemplo, de un matraz de 40 capas. Para acelerar el proceso de transferencia de fluidos, se pueden usar bombas externas de alto caudal para transferir primero el contenido tripsinizado a una bolsa de transferencia, seguido de lavar / concentrar y recolectar las células de la bolsa de transferencia utilizando el sistema de centrifugación de contraflujo. Además, este protocolo también se puede aplicar para pasar celdas de matraces multicapa de 4 capas a 10 capas. Más arriba, el sistema de centrifugación de contraflujo también podría optimizarse para el lavado de hMSC descongelados y la cosecha directa y la formulación media en matraces de varias capas para iniciar el tren de semillas. Cabe señalar que el número mínimo de células necesarias para formar el lecho fluidizado en la cámara de centrifugación de contraflujo es de aproximadamente 30 millones de células, y el volumen máximo recomendado para procesar por lote es de 20 L.
Actualmente, la fijación del conjunto de tubos personalizado al matraz multicapa en el gabinete de bioseguridad y el esterilizado en autoclave de las partes de los componentes no son deseables en un entorno cGMP. Como alternativa, un conjunto de tubos esterilizado gamma personalizado podría subcontratarse a proveedores. Los proveedores que proporcionan matraces multicapa también ofrecen la opción de preajustar los matraces con los conjuntos de tubos deseados, incluido un filtro de 0,2 μm, y la esterilización gamma de todo el equipo. Esto aseguraría que los matraces de varias capas y los tubos conectados estén realmente cerrados, lo que significa que el proceso podría completarse en el banco en un entorno de sala limpia de Clase C.
Este proceso que utiliza el sistema de centrifugación de contraflujo no se limita a células cultivadas basadas en adherentes en un recipiente de múltiples capas y podría adaptarse a plataformas de expansión de celdas dinámicas (biorreactores de tanque agitado o de onda) y estáticas (permeables al gas). Específicamente, para hMSC expandidos en cultivos de microportadores 3D, los protocolos se pueden optimizar en el sistema de centrifugación de contraflujo para cosechar, lavar y formular los hMSC disociados de los microportadores.
En general, el creciente interés en el desarrollo de terapias celulares traslacionales con una mayor robustez y fiabilidad del proceso ha llevado al desarrollo de plataformas de procesamiento celular cerradas y automatizadas. Estos sistemas son imprescindibles, ya que reducen el número de pasos de manipulación, evitan la contaminación potencial por conexiones estériles y reducen los costos de fabricación al reducir la mano de obra y mejorar el uso efectivo del espacio de la sala limpia21. En línea con esto, muchos de los desarrolladores de productos de terapia celular que buscan la aprobación regulatoria para traducir sus terapias son conscientes de la importancia de cerrar el proceso e implementar la automatización completa o semiautomatización ya en la etapa de desarrollo del proceso 14,31,32.
Con el uso de un medio SFM XF respetuoso con la regulación, y junto con reactivos auxiliares que cumplen con 21 CFR GMP Parte 11 y las pautas internacionales de calidad, este proceso semiautomatizado sería fácilmente adecuado para la fabricación clínica. Hemos demostrado la reproducibilidad del proceso cerrado y el mantenimiento de la calidad de los WJ-MSC. Mejorar la eficiencia y la seguridad del cultivo de células basadas en adherentes en matraces multicapa beneficiaría no solo al campo de la terapia hMSC, sino también a las empresas en bancos de líneas celulares y producción de virus adherentes.
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer el apoyo de la financiación del Fondo de Alineación de la Industria (IAF-PP) (H18/01/a0/021 y H18/AH/a0/001) de A*STAR, Singapur.
2L PVC transfer bag | TerumoBCT | BB*B200TM | |
Alcian blue solution, pH 2.5 | Merck | 101647 | |
Alizarin-Red Staining Solution | Merck | TMS-008-C | |
APC anti-human CD73 Antibody | Biolegend | 344015 | |
APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | Biolegend | 400121 | |
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader | Bio-Rad | ||
Counterflow Centrifugation System | Thermo Fisher Scientific | A47679 | Gibco CTS Rotea Counterflow Centrifugation System |
Crystal Violet | Sigma-aldrich | C0775 | |
CTS (L-alanyl-L-glutamine) GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
CTS Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | A1285601 | no calcium, no magnesium |
CTS Recombinant Human Vitronectin (VTN-N) | Thermo Fisher Scientific | A27940 | |
CTS TrypLE Select Enzyme | Thermo Fisher Scientific | A1285901 | |
Custom tubing assembly | Saint-Gobain and Colder Product Company (CPC) | N/A | Gamma-sterilized 3/32” ID PVC line fitted with a sterile male MPC (1/8” barb) and sealed on the other end. Autoclave a short C-Flex line fitted with a sterile Cell Factory port connector on one end and a female MPC (3/8” barb) on the other. Connect the PVC and C-Flex lines in a biosafety cabinet |
Emflon II capsule (0.2um filter) | Pall | KM5V002P2G100 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12662029 | Mesenchymal stem cell-qualified, USDA-approved regions |
FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | |
FITC anti-human CD105 Antibody | Biolegend | 323203 | |
FITC anti-human CD45 Antibody | Biolegend | 304005 | |
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody | Biolegend | 328107 | |
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | Biolegend | 400109 | |
Hi-Flow Single Use Kit | Thermo Fisher Scientific | A46575 | Gibco CTS Rotea Hi-flow single-use kit, flow rate of 30 – 165 mL/min |
Multi-layered systems | Thermo Fisher Scientific | 140360 (4-layers); 140410 (10-layers) | Nunc Standard Cell Factory Systems |
NucleoCounter NC-3000 | Chemometec | NC-3000 | |
Oil red O staining solution | Merck | 102419 | |
PDGF-BB | Thermo Fisher Scientific | PHG0045 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
PerCP anti-human CD34 Antibody | Biolegend | 343519 | |
PerCP Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody | Biolegend | 400147 | |
ProcartaPlex Multiplex Immunoassays | Thermo Fisher Scientific | Custom 19-Plex panel: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2 , MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, PDGF-BB, RANTES, SDF-1α, TGFα, TNF-alpha, VEGF-A | |
Sample port | Thermo Fisher Scientific | A50111 | Gamma-sterilized leur sample port with 2 PVC lines attached |
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher Scientific | A10070-01 | |
StemPro Chondrocyte Differentiation | Thermo Fisher Scientific | A10071-01 | |
StemPro Custom MSC SF XF Medium Kit (SFM XF medium) | Thermo Fisher Scientific | ME20236L1 | Contains StemPro MSC SFM Basal Medium and Custom MSC SF XF Supplement (100x) |
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher Scientific | A10072-01 | |
T175 Nunc EasYFlask | Thermo Fisher Scientific | 159910 | |
T75 Nunc EasYFlask | Thermo Fisher Scientific | 156472 | |
TGFβ1 | Thermo Fisher Scientific | PHG9204 | |
WJ MSCs | PromoCell | (#C12971; Germany) | Human mesenchymal stem cells |
αMEM media | Thermo Fisher Scientific | 12571063 | With nucleosides |