In vivo Genlevering til musebrystepitelceller gennem brystintraduktal injektion

Summary

Denne protokol beskriver intraduktal injektion af virale vektorer via sutten for at levere gener af interesse i brystepitelcellerne.

Abstract

Musens brystkirtler omfatter duktale træer, som er foret med epitelceller og har en åbning på spidsen af hver brystvorte. Epitelcellerne spiller en vigtig rolle i brystkirtelfunktionen og er oprindelsen til de fleste brysttumorer. Introduktion af gener af interesse i musebrystepitelceller er et kritisk skridt i evalueringen af genfunktionen i epitelceller og generering af musebrysttumormodeller. Dette mål kan opnås gennem intraduktal injektion af en viral vektor, der bærer generne af interesse i musens brystkanaltræ. Den injicerede virus inficerer efterfølgende brystepitelceller, hvilket bringer generne af interesse ind. Den virale vektor kan være lentiviral, retroviral, adenoviral eller adenovirusassocieret viral (AAV). Denne undersøgelse viser, hvordan et gen af interesse leveres til brystepitelceller gennem musebryst intraduktal injektion af en viral vektor. Et lentivirus, der bærer GFP , bruges til at vise stabil ekspression af et leveret gen, og et retrovirus, der bærer Erbb2 (HER2 / Neu), bruges til at demonstrere onkogeninducerede atypiske hyperplastiske læsioner og brysttumorer.

Introduction

Epitelceller i brystkirtler spiller en vigtig rolle i funktionen af disse kirtler og er den vigtigste celle af oprindelse af brystkræft. Undersøgelser af brystkirtelbiologi og tumorigenese ofte har brug for levering af gen (r) af interesse i disse celler. Hver mus brystkirtel består af et duktalt træ foret med epitelceller med en enkelt åbning på spidsen af brystvorten. Denne struktur gør brystepitelcellerne let tilgængelige for virale vektorer, som kan leveres ind i lumen i et duktalt træ via intraduktal injektion¹.

Teknikken til brystintraduktal injektion blev oprindeligt brugt til meget større dyr som geder, kaniner og rotter¹. For et meget mindre dyr som mus har intraduktal injektion brug for mange sarte værktøjer og mere praksis hos operatørerne. Der er to tilgange til intraduktal injektion med mus. Den ene er up-the-patteinjektion¹. En anden er den direkte injektion af den primære kanal af # 3 eller # 4 brystkirtel efter kirurgisk eksponering¹. Da den første er ikke-invasiv og hurtigere, når operatøren er veluddannet, er denne teknik mere almindeligt anvendt og vil blive beskrevet detaljeret i denne artikel.

Sammenlignet med de udbredte traditionelle transgene musemodeller, hvor genet af interesse introduceres på stadiet af befrugtede æg gennem mikroinjektion ^2,3,4, har genlevering gennem den intraduktale virusinjektionsmetode mange fordele^, herunder: (1) det undgår den tidskrævende proces med at lave en transgen muselinje for hvert gen af interesse; (2) det undgår potentiel forringelse af den normale udvikling af brystkirtler pålagt af genet af interesse; (3) det introducerer genet af interesse på et hvilket som helst ønsket tidspunkt efter fødslen; (4) det kan let samintroducere mere end et gen af interesse; (5) det efterligner bedre den naturlige tumorigene proces, fordi de inficerede og dermed onkogenbærende celler er omgivet af normale celler; og (6) i kombination med TVA-teknologien (tumorvirus A, et fuglecelleoverfladeprotein og receptoren for retrovirus RCAS-vektor)⁵ kan genet af interesse indføres i en specifik cellepopulation for at undersøge tumorigenesens celleoprindelse og udføre celleafstamningssporingsassays i brystkirtlerne 6,7,8^{, 9}.

Alle vektorer afledt af retrovirus¹⁰, lentivirus 11,12^, adenovirus¹³ og adenovirusassocieret virus (AAV)¹⁴ kan anvendes til intraduktal levering af genetisk materiale. Retrovirus- og lentivirusvektorer integreres permanent i værtsgenomet; Således introducerer de gener af interesse stabilt i brystepitelceller. Mens lentivirus kan integreres i genomet i enhver celle, den møder¹⁵, har den effektive genomiske integration af retrovirus brug for spredning af målcellerne¹⁶. De adenovirale og AAV-vektorer integreres ikke i genomet af inficerede celler og udtrykker derfor kun forbigående genet^{af interesse 17,18}. Denne funktion kan være en fordel, når genet af interesse kun skal udtrykkes i kort tid, såsom Cre, for at slette et floxed tumorsuppressorgen.

Lentivirus, adenovirus og AAV inficerer alle museceller, de støder på. Men da luminalepitel stort set er isoleret fra det underliggende basale lag, som yderligere adskilles fra stroma af kældermembranen, begrænser intraduktal injektion infektionen stort set til luminale epitelceller, den primære oprindelsescelle for brystkræft. Inden for dette luminale epitellag er der også forskellige celleundertyper, herunder stamceller, stamceller og flere grupper af differentierede celler. For at inficere specifikke celleundergrupper inden for luminalcellepopulationen kan TVA-teknologien anvendes, hvormed fugleleukosevirusafledte RCAS-vektorer^5,10 eller pseudotypede lentivirale vektorer¹¹ selektivt inficerer de celler, der udtrykker TVA, i mus, der bærer et TVA-transgen under kontrol af en celletypespecifik promotor, såsom en promotor^, der kun er aktiv i stamceller 6 eller visse forfædre^{6 7} eller alveolære celler⁸ eller Wnt-pathway aktive celler⁹.

Denne protokol præsenterer teknikken til at indføre gener af interesse i brystepitelceller gennem intraduktal injektion af en viral vektor. Påvisning af ekspression af de indførte gener og de resulterende hyperplastiske læsioner og tumorer demonstreres derefter.

Protocol

Alle forsøg med mus blev udført i overensstemmelse med den Institutionelle Animal Care and Use Committee-godkendte dyreprotokol. Til denne undersøgelse blev 9-12 uger gamle FVB/N- eller MMTV-tva-hunmus anvendt. Musene blev anskaffet kommercielt eller selvfremstillet (se materialetabel). Lenti-EGFP (FUCGW) og RCAS-Erbb2 (Neu) vira blev anvendt. Viruspræparation og titerbestemmelse blev udført efter de tidligere offentliggjorte rapporter10,12</su…

Representative Results

Repræsentative data præsenteres her for at demonstrere vellykket intraduktal injektion, vellykket virusinfektion og virkningen af de leverede gener på brysttumorgenese. Mængden af injiceret virus skal tilpasses formålet med hvert forsøg. For at illustrere, hvor omfattende brystkanaltræet kan inficeres, skal der bruges en stor mængde virusbærende gener, der kan afbildes, såsom GFP. På den anden side, for at efterligne den naturlige spontane tumorgenese, skal en lille mængde virus, der bærer et onkogen, anvend…

Discussion

Denne artikel demonstrerer den virale intraduktale injektionsteknik til introduktion af gener i musebrystepitelceller til modellering af sporadisk brystkræft. Normalt injiceres mus på mindst 5 uger eller ældre, så den onkogene proces starter, efter at brystkirtlen er udviklet. Desuden er brystvorteåbningen hos mus yngre end 5 uger gamle ofte for lille til injektion. På den anden side er brystvorterne hos meget gamle mus undertiden degenererede, og transektion kan muligvis ikke afsløre en kanalåbning. Det er også…

Materials

Anti-HA antibody	Covance	MMS-101P	Dilution: 1 : 1000
Artificial Tears	Covetrus	NDC 11695-0832-1
Bromophenol blue	Sigma	B5525	microwave radiation for 45 seconds at power high of 1250W microwave oven
FACSCantoII	BD Biosciences	V96100899
Fluorescent stereomicroscope	Leica	MZ16 FA
FUCGW lenti-virus	Self-made	N/A	See reference # 12
FVB/N	The Jackson Laboratory	JAX:001800
Hamilton needle	Hamilton	91033	autoclaved
Hamilton syringe	Hamilton	201000	autoclaved
LED magnifying lamp	Intertek	3165273
Micro dissection spring scissor	Roboz	RS-5621	autoclaved
MMTV-tva	Self-made		See reference # 10
RCAS-Neu (HA)	Self-made	N/A	See reference # 10
Rodent Comboanesthetic III	Veterinary Pharmacy	Veterinary prescription	37.6 mg/mL ketamine, 1.92 mg/mL xylazine, and 0.38 mg/mL acepromazine