विवो में स्तन इंट्राडक्टल इंजेक्शन के माध्यम से माउस स्तन उपकला कोशिकाओं में जीन वितरण
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल स्तन उपकला कोशिकाओं में रुचि के जीन देने के लिए टेट के माध्यम से वायरल वैक्टर के इंट्राडक्टल इंजेक्शन का वर्णन करता है।
Abstract
माउस स्तन ग्रंथियों में डक्टल पेड़ होते हैं, जो उपकला कोशिकाओं द्वारा पंक्तिबद्ध होते हैं और प्रत्येक निप्पल के सिरे पर एक उद्घाटन होता है। उपकला कोशिकाएं स्तन ग्रंथि समारोह में एक प्रमुख भूमिका निभाती हैं और अधिकांश स्तन ट्यूमर की उत्पत्ति होती हैं। माउस स्तन उपकला कोशिकाओं में रुचि के जीन पेश करना उपकला कोशिकाओं में जीन समारोह का मूल्यांकन करने और माउस स्तन ट्यूमर मॉडल उत्पन्न करने में एक महत्वपूर्ण कदम है। इस लक्ष्य को एक वायरल वेक्टर के इंट्राडक्टल इंजेक्शन के माध्यम से पूरा किया जा सकता है जो माउस स्तन डक्टल पेड़ में रुचि के जीन ले जाता है। इंजेक्शन वायरस बाद में स्तन उपकला कोशिकाओं को संक्रमित करता है, जिससे रुचि के जीन आते हैं। वायरल वेक्टर लेंटिवायरल, रेट्रोवायरल, एडेनोवायरल या एडेनोवायरस से जुड़े वायरल (एएवी) हो सकता है। यह अध्ययन दर्शाता है कि वायरल वेक्टर के माउस स्तन इंट्राडक्टल इंजेक्शन के माध्यम से स्तन उपकला कोशिकाओं में रुचि का एक जीन कैसे पहुंचाया जाता है। जीएफपी ले जाने वाले एक लेंटीवायरस का उपयोग एक वितरित जीन की स्थिर अभिव्यक्ति दिखाने के लिए किया जाता है, और एक रेट्रोवायरस ले जाने वाले एर्ब 2 (एचईआर 2 / एनयू) का उपयोग ऑन्कोजीन-प्रेरित एटिपिकल हाइपरप्लास्टिक घावों और स्तन ट्यूमर को प्रदर्शित करने के लिए किया जाता है।
Introduction
स्तन ग्रंथियों की उपकला कोशिकाएं इन ग्रंथियों के कार्य में एक प्रमुख भूमिका निभाती हैं और स्तन कैंसर की उत्पत्ति की प्रमुख कोशिका हैं। स्तन ग्रंथि जीव विज्ञान और ट्यूमरजेनिसिस के अध्ययन में अक्सर इन कोशिकाओं में रुचि के जीन (ओं) के वितरण की आवश्यकता होती है। प्रत्येक माउस स्तन ग्रंथि में उपकला कोशिकाओं द्वारा पंक्तिबद्ध एक डक्टल पेड़ होता है जिसमें निप्पल की नोक पर एक एकल उद्घाटन होता है। यह संरचना स्तन उपकला कोशिकाओं को वायरल वैक्टर के लिए आसानी से सुलभ बनाती है, जिसे इंट्राडक्टल इंजेक्शन1 के माध्यम से एक डक्टल पेड़ के लुमेन में पहुंचाया जा सकता है।
स्तन इंट्राडक्टल इंजेक्शन की तकनीक मूल रूप से बकरियों, खरगोशों और चूहोंजैसे बहुत बड़े जानवरों के लिए उपयोग की जाती थी। चूहों जैसे बहुत छोटे जानवर के लिए, इंट्राडक्टल इंजेक्शन को कई नाजुक उपकरणों और ऑपरेटरों की अधिक प्रथाओं की आवश्यकता होती है। माउस इंट्राडक्टल इंजेक्शन के लिए दो दृष्टिकोण हैं। एक अप-द-टेट इंजेक्शन1 है। एक और सर्जिकल एक्सपोजर1 के बाद # 3 या # 4 स्तन ग्रंथि के प्राथमिक वाहिनी का प्रत्यक्ष इंजेक्शन है। चूंकि ऑपरेटर को अच्छी तरह से प्रशिक्षित करने के बाद पहला गैर-आक्रामक और तेज है, इसलिए इस तकनीक का अधिक उपयोग किया जाता है और इस लेख में विस्तार से वर्णित किया जाएगा।
व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले पारंपरिक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल की तुलना में, जिसमें माइक्रोइंजेक्शन 2,3,4 के माध्यम से निषेचित अंडे के चरण में रुचि का जीन पेश किया जाता है, इंट्राडक्टल वायरस इंजेक्शन विधि के माध्यम से जीन वितरण के कई फायदे हैं, जिनमें शामिल हैं: (1) यह रुचि के प्रत्येक जीन के लिए ट्रांसजेनिक माउस लाइन बनाने की समय लेने वाली प्रक्रिया से बचता है; (2) यह रुचि के जीन द्वारा लगाए गए स्तन ग्रंथियों के सामान्य विकास पर संभावित हानि से बचता है; (3) यह जन्म के बाद किसी भी वांछित समय पर रुचि के जीन का परिचय देता है; (4) यह आसानी से रुचि के एक से अधिक जीन को सह-पेश कर सकता है; (5) यह प्राकृतिक ट्यूमरोजेनिक प्रक्रिया की बेहतर नकल करता है क्योंकि संक्रमित और इस प्रकार ऑन्कोजीन-ले जाने वाली कोशिकाएं सामान्य कोशिकाओं से घिरी होती हैं; और (6) टीवीए (ट्यूमर वायरस ए, एक एवियन सेल सतह प्रोटीन और रेट्रोवायरस आरसीएएस वेक्टर के लिए रिसेप्टर) तकनीक5 के संयोजन में, रुचि के जीन को ट्यूमरजेनिसिस की कोशिका उत्पत्ति का अध्ययन करने और स्तनग्रंथियों में सेल वंश-अनुरेखण परख का संचालन करने के लिए एक विशिष्ट सेल आबादी में पेश किया जा सकता है। 9.
रेट्रोवायरस 10, लेंटीवायरस 11,12, एडेनोवायरस 13, और एडेनोवायरस से जुड़े वायरस (एएवी) 14 से प्राप्त किसी भी वैक्टर का उपयोग आनुवंशिक सामग्री के इंट्राडक्टल वितरण के लिए किया जा सकता है। रेट्रोवायरस और लेंटिवायरस वैक्टर स्थायी रूप से मेजबान जीनोम में एकीकृत होते हैं; इस प्रकार, वे स्तन उपकला कोशिकाओं में स्थिर रूप से रुचि के जीन पेश करते हैं। जबकि लेंटीवायरस किसी भी सेल के जीनोम में एकीकृत हो सकता है जो15 का सामना करता है, रेट्रोवायरस के कुशल जीनोमिक एकीकरण को लक्ष्य कोशिकाओंके प्रसार की आवश्यकता होती है। एडेनोवायरल और एएवी वैक्टर संक्रमित कोशिकाओं के जीनोम में एकीकृत नहीं होते हैं और इसलिए, केवल क्षणिक रूपसे रुचि के जीन को व्यक्त करते हैं। यह सुविधा एक लाभ हो सकती है जब रुचि के जीन को केवल थोड़े समय के लिए व्यक्त करने की आवश्यकता होती है, जैसे कि सीआरई, एक फ्लोक्स्ड ट्यूमर शमन जीन को हटाने के लिए।
लेंटिवायरस, एडेनोवायरस और एएवी किसी भी माउस कोशिकाओं को संक्रमित करते हैं जो वे सामना करते हैं। लेकिन चूंकि ल्यूमिनल एपिथेलियम काफी हद तक अंतर्निहित बेसल परत से अछूता है, जिसे आगे तहखाने की झिल्ली द्वारा स्ट्रोमा से अलग किया जाता है, इंट्राडक्टल इंजेक्शन संक्रमण को बड़े पैमाने पर ल्यूमिनल उपकला कोशिकाओं तक सीमित करता है, जो स्तन कैंसर की उत्पत्ति की प्राथमिक कोशिका है। इस ल्यूमिनल उपकला परत के भीतर, स्टेम सेल, पूर्वज कोशिकाओं और विभेदित कोशिकाओं के कई समूहों सहित अलग-अलग सेल उपप्रकार भी हैं। ल्यूमिनल सेल आबादी के भीतर विशिष्ट सेल उपसमुच्चय को संक्रमित करने के लिए, टीवीए तकनीक का उपयोग किया जा सकता है, जिसके साथ एवियन ल्यूकोसिस वायरस-व्युत्पन्न आरसीएएस वैक्टर5,10 या स्यूडोटाइप्ड लेंटिवायरल वैक्टर11 चुनिंदा रूप से उन कोशिकाओं को संक्रमित करते हैं जो चूहों में टीवीए को व्यक्त करते हैं जो सेल प्रकार-विशिष्ट प्रमोटर के नियंत्रण में एक टीवीए ट्रांसजेन ले जाते हैं, जैसे कि एक प्रमोटर जो केवल स्टेम सेल6 या कुछ पूर्वजों6 में सक्रिय है। 7 या वायुकोशीय कोशिकाएं8 या डब्ल्यूएनटी-मार्ग सक्रिय कोशिकाएं9.
यह प्रोटोकॉल एक वायरल वेक्टर के इंट्राडक्टल इंजेक्शन के माध्यम से स्तन उपकला कोशिकाओं में रुचि के जीन पेश करने की तकनीक प्रस्तुत करता है। पेश किए गए जीन की अभिव्यक्ति का पता लगाना और परिणामस्वरूप हाइपरप्लास्टिक घावों और ट्यूमर का प्रदर्शन किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह लेख छिटपुट स्तन कैंसर मॉडलिंग के लिए माउस स्तन उपकला कोशिकाओं में जीन पेश करने के लिए वायरल इंट्राडक्टल इंजेक्शन तकनीक को प्रदर्शित करता है। आमतौर पर, कम से कम 5 सप्ताह या उससे अधिक उम्र के चूहों को इ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस पांडुलिपि पर उनकी उपयोगी टिप्पणियों के लिए डॉ गैरी चामनेस को धन्यवाद देते हैं। इस काम को रक्षा विभाग (डीओडी) सीडीएमआरपी बीसी 191649 (वाईएल) और बीसी 191646 (वाईएल) के साथ-साथ राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) सीए 271498 (वाईएल) द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक स्पोर पी 50 सीए 186784 द्वारा समर्थित स्तन केंद्र पैथोलॉजी कोर सुविधा और जोएल एम सेडरस्ट्रॉम की सहायता से सीपीआरआईटी-आरपी 180672, एनआईएच सीए 125123 और आरआर 024574 द्वारा समर्थित साइटोमेट्री और सेल सॉर्टिंग कोर को धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| Anti-HA antibody | Covance | MMS-101P | Dilution: 1 : 1000 |
| Artificial Tears | Covetrus | NDC 11695-0832-1 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525 | microwave radiation for 45 seconds at power high of 1250W microwave oven |
| FACSCantoII | BD Biosciences | V96100899 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | |
| FUCGW lenti-virus | Self-made | N/A | See reference # 12 |
| FVB/N | The Jackson Laboratory | JAX:001800 | |
| Hamilton needle | Hamilton | 91033 | autoclaved |
| Hamilton syringe | Hamilton | 201000 | autoclaved |
| LED magnifying lamp | Intertek | 3165273 | |
| Micro dissection spring scissor | Roboz | RS-5621 | autoclaved |
| MMTV-tva | Self-made | See reference # 10 | |
| RCAS-Neu (HA) | Self-made | N/A | See reference # 10 |
| Rodent Comboanesthetic III | Veterinary Pharmacy | Veterinary prescription | 37.6 mg/mL ketamine, 1.92 mg/mL xylazine, and 0.38 mg/mL acepromazine |
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