생체 내 유방 관내 주입을 통한 마우스 유방 상피 세포로의 유전자 전달
Summary
본 프로토콜은 유방 상피 세포에 관심 유전자를 전달하기 위해 젖꼭지를 통한 바이러스 벡터의 관내 주입을 설명합니다.
Abstract
마우스 유선은 상피 세포가 늘어서 있고 각 젖꼭지 끝에 하나의 구멍이 있는 관 나무로 구성됩니다. 상피 세포는 유선 기능에 중요한 역할을 하며 대부분의 유선 종양의 기원입니다. 관심 유전자를 마우스 유선 상피 세포에 도입하는 것은 상피 세포에서 유전자 기능을 평가하고 마우스 유방 종양 모델을 생성하는 데 중요한 단계입니다. 이 목표는 관심 유전자를 마우스 유관 나무에 운반하는 바이러스 벡터의 관내 주입을 통해 달성할 수 있습니다. 주입된 바이러스는 이후 유방 상피 세포를 감염시켜 관심 유전자를 가져옵니다. 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 또는 아데노바이러스 관련 바이러스 (AAV)일 수 있다. 이 연구는 바이러스 벡터의 마우스 유방 관내 주입을 통해 관심 유전자가 유방 상피 세포로 전달되는 방법을 보여줍니다. GFP 를 운반하는 렌티바이러스는 전달된 유전자의 안정적인 발현을 나타내는 데 사용되며, Erbb2 를 운반하는 레트로바이러스(HER2/Neu)는 종양유전자 유발 비정형 과형성 병변 및 유방 종양을 입증하는 데 사용됩니다.
Introduction
유선의 상피 세포는 이러한 땀샘의 기능에 중요한 역할을 하며 유방암의 주요 원인 세포입니다. 유선 생물학 및 종양 형성에 대한 연구는 종종 관심 유전자를 이러한 세포에 전달해야 합니다. 각 마우스 유선은 유두 끝에 단일 구멍이 있는 상피 세포가 늘어선 관 나무로 구성됩니다. 이러한 구조는 유방 상피 세포가 바이러스 벡터에 쉽게 접근할 수 있도록 하며, 이는 관내 주입을 통해 관 나무의 내강으로 전달될 수 있다1.
유방 관내 주사 기술은 원래 염소, 토끼, 쥐와 같은 훨씬 더 큰 동물에게 사용되었다1. 생쥐와 같은 훨씬 작은 동물의 경우 관 내 주사에는 많은 섬세한 도구와 작업자의 더 많은 관행이 필요합니다. 마우스 관내 주입에는 두 가지 접근법이 있습니다. 하나는 up-the-teat injection1입니다. 또 다른 하나는 외과적 노출 후 #3 또는 #4 유선의 1차 덕트를 직접 주입하는 것입니다1. 첫 번째 기술은 비침습적이고 작업자가 잘 훈련되면 더 빠르기 때문에 이 기술이 더 일반적으로 사용되며 이 기사에서 자세히 설명합니다.
미세주입을 통해 수정란의 단계에서 관심의 유전자가 도입되는 널리 사용되는 전통적인 형질전환 마우스 모델과 비교하여2,3,4, 관내 바이러스 주입 방법을 통한 유전자 전달은 다음을 포함하는 많은 이점을 갖는다: (1) 관심있는 각 유전자에 대해 형질전환 마우스 라인을 만드는 시간 소모적인 과정을 피한다; (2) 관심 유전자에 의해 부과 된 유방 땀샘의 정상적인 발달에 대한 잠재적 손상을 피한다. (3) 출생 후 원하는 시간에 관심 유전자를 도입합니다. (4) 하나 이상의 관심 유전자를 쉽게 공동 도입할 수 있습니다. (5) 감염된 종양 유전자 운반 세포가 정상 세포로 둘러싸여 있기 때문에 자연 종양 형성 과정을 더 잘 모방합니다. (6) TVA(종양 바이러스 A, 조류 세포 표면 단백질 및 레트로바이러스 RCAS 벡터에 대한 수용체) 기술5와 조합하여, 관심 유전자를 특정 세포 집단에 도입하여 종양 형성의 세포 기원을 연구하고 유선에서 세포 계통 추적 분석을 수행할 수 있습니다 6,7,8, 9입니다.
레트로바이러스 10, 렌티바이러스 11,12, 아데노바이러스 13 및 아데노바이러스 관련 바이러스(AAV)14로부터 유래된 임의의 벡터는 유전 물질의 관내 전달에 사용될 수 있다. 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터는 숙주 게놈에 영구적으로 통합됩니다. 따라서 그들은 관심 유전자를 유방 상피 세포에 안정적으로 도입합니다. 렌티바이러스는 마주치는 모든 세포의 게놈에 통합될 수 있지만15), 레트로바이러스의 효율적인 게놈 통합은 표적 세포의 증식을 필요로 한다16. 아데노바이러스 및 AAV 벡터는 감염된 세포의 게놈에 통합되지 않으므로 관심 유전자를 일시적으로 발현합니다17,18. 이 특징은 관심 유전자가 플록싱된 종양 억제 유전자를 삭제하기 위해 Cre와 같이 짧은 시간 동안만 발현되어야 할 때 이점이 될 수 있습니다.
렌티바이러스, 아데노바이러스 및 AAV는 만나는 모든 마우스 세포를 감염시킵니다. 그러나 내강 상피는 기저막에 의해 간질과 더 분리된 기저층으로부터 크게 절연되어 있기 때문에 관내 주사는 감염을 주로 유방암의 기원 세포인 내강 상피 세포로 제한합니다. 이 내강 상피층 내에는 줄기 세포, 전구 세포 및 여러 분화 세포 그룹을 포함한 별개의 세포 아형도 있습니다. 내강 세포 집단 내의 특정 세포 하위세트를 감염시키기 위해, TVA 기술이 사용될 수 있으며, 이 기술과 함께 조류 백혈병 바이러스-유래 RCAS 벡터(5,10) 또는 슈도타입 렌티바이러스 벡터(11)는 줄기 세포(6) 또는 특정 전구체(6)에서만 활성인 프로모터와 같은 세포 유형-특이적 프로모터의 제어하에 tva 도입유전자를 운반하는 마우스에서 TVA를 발현하는 세포를 선택적으로 감염시킨다. 7 또는 폐포 세포(8) 또는 Wnt-경로 활성 세포(9).
이 프로토콜은 바이러스 벡터의 관내 주입을 통해 관심 유전자를 유선 상피 세포에 도입하는 기술을 제시합니다. 도입 된 유전자의 발현 및 결과적인 증식 병변 및 종양의 검출이 입증된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 기사는 산발성 유방암을 모델링하기 위해 마우스 유방 상피 세포에 유전자를 도입하기 위한 바이러스 관내 주입 기술을 보여줍니다. 일반적으로 적어도 5 주 이상의 마우스를 주사하여 유선이 발달 한 후 발암 과정이 시작됩니다. 게다가, 생후 5주 미만의 쥐의 젖꼭지 입구는 종종 주사하기에는 너무 작습니다. 반면에, 아주 오래된 생쥐의 젖꼭지는 때때로 퇴화되고, 절개는 관 개구부를 드러내…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 원고에 대한 도움이 되는 의견을 주신 Dr. Gary Chamness에게 감사드립니다. 이 작업은 국방부 (DOD) CDMRP BC191649 (YL) 및 BC191646 (YL)과 국립 보건원 (NIH) CA271498 (YL)의 지원을 받았습니다. 저자는 SPORE P50CA186784가 지원하는 유방 센터 병리학 핵심 시설과 Joel M. Sederstrom의 도움을 받아 CPRIT-RP180672, NIH CA125123 및 RR024574가 지원하는 세포 분석 및 세포 분류 코어에 감사드립니다.
Materials
| Anti-HA antibody | Covance | MMS-101P | Dilution: 1 : 1000 |
| Artificial Tears | Covetrus | NDC 11695-0832-1 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525 | microwave radiation for 45 seconds at power high of 1250W microwave oven |
| FACSCantoII | BD Biosciences | V96100899 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | |
| FUCGW lenti-virus | Self-made | N/A | See reference # 12 |
| FVB/N | The Jackson Laboratory | JAX:001800 | |
| Hamilton needle | Hamilton | 91033 | autoclaved |
| Hamilton syringe | Hamilton | 201000 | autoclaved |
| LED magnifying lamp | Intertek | 3165273 | |
| Micro dissection spring scissor | Roboz | RS-5621 | autoclaved |
| MMTV-tva | Self-made | See reference # 10 | |
| RCAS-Neu (HA) | Self-made | N/A | See reference # 10 |
| Rodent Comboanesthetic III | Veterinary Pharmacy | Veterinary prescription | 37.6 mg/mL ketamine, 1.92 mg/mL xylazine, and 0.38 mg/mL acepromazine |
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