In vivo Entrega de Genes em Células Epiteliais Mamárias de Camundongos Através de Injeção Intraductal Mamária
Summary
O presente protocolo descreve a injeção intraductal de vetores virais via teto para entregar genes de interesse nas células epiteliais mamárias.
Abstract
As glândulas mamárias de camundongos compreendem árvores ductais, que são revestidas por células epiteliais e têm uma abertura na ponta de cada mamilo. As células epiteliais desempenham um papel importante na função da glândula mamária e são a origem da maioria dos tumores mamários. A introdução de genes de interesse em células epiteliais mamárias de camundongos é um passo crítico na avaliação da função gênica em células epiteliais e na geração de modelos de tumores mamários de camundongos. Este objetivo pode ser alcançado através da injeção intraductal de um vetor viral carreando os genes de interesse na árvore ductal mamária de camundongos. Posteriormente, o vírus injetado infecta células epiteliais mamárias, trazendo os genes de interesse. O vetor viral pode ser lentiviral, retroviral, adenoviral ou viral associado a adenovírus (AAV). Este estudo demonstra como um gene de interesse é entregue em células epiteliais mamárias através da injeção intraductal mamária de um vetor viral em camundongos. Um lentivírus carreando GFP é usado para mostrar a expressão estável de um gene liberado, e um retrovírus carreando Erbb2 (HER2/Neu) é usado para demonstrar lesões hiperplásicas atípicas induzidas por oncogenes e tumores mamários.
Introduction
As células epiteliais das glândulas mamárias desempenham um papel importante na função dessas glândulas e são a principal célula de origem do câncer de mama. Estudos da biologia da glândula mamária e tumorigênese frequentemente necessitam da entrega de gene(s) de interesse nessas células. Cada glândula mamária de camundongo compreende uma árvore ductal revestida por células epiteliais com uma única abertura na ponta do mamilo. Essa estrutura torna as células epiteliais mamárias facilmente acessíveis aos vetores virais, que podem ser liberados para a luz de uma árvore ductal por injeção intraductal1.
A técnica de injeção intraductal mamária foi originalmente utilizada para animais muito maiores, como cabras, coelhos e ratos1. Para um animal muito menor, como camundongos, a injeção intraductal precisa de muitas ferramentas delicadas e mais práticas dos operadores. Existem duas abordagens para injeção intraductal em camundongos. Uma delas é a injeção de teto1. Outra é a injeção direta do ducto primário da glândula mamária #3 ou #4 após exposição cirúrgica1. Como a primeira é não invasiva e mais rápida uma vez que o operador tenha sido bem treinado, essa técnica é mais comumente usada e será descrita em detalhes neste artigo.
Em comparação com os modelos tradicionais de camundongos transgênicos amplamente utilizados, nos quais o gene de interesse é introduzido na fase de ovos fertilizados por microinjeção 2,3,4, a liberação gênica pelo método de injeção intraductal de vírus apresenta muitas vantagens, incluindo: (1) evita o demorado processo de confecção de uma linhagem de camundongo transgênico para cada gene de interesse; (2) evita possíveis prejuízos no desenvolvimento normal das glândulas mamárias impostos pelo gene de interesse; (3) introduz o gene de interesse em qualquer momento desejado após o nascimento; (4) pode facilmente co-introduzir mais de um gene de interesse; (5) mimetiza melhor o processo tumorigênico natural, pois as células infectadas e, portanto, portadoras de oncogenes são circundadas por células normais; e (6) em combinação com a tecnologia TVA (tumor virus A, uma proteína de superfície celular aviária e receptor para vetor RCAS de retrovírus)5, o gene de interesse pode ser introduzido em uma população celular específica para estudar a origem celular da tumorigênese e conduzir ensaios de rastreamento de linhagem celular nas glândulas mamárias 6,7,8, 9º.
Quaisquer vetores derivados de retrovírus10, lentivírus 11,12, adenovírus13 e vírus associado a adenovírus (AAV)14 podem ser usados para liberação intraductal de materiais genéticos. Vetores de retrovírus e lentivírus integram-se ao genoma do hospedeiro permanentemente; assim, introduzem genes de interesse de forma estável nas células epiteliais mamárias. Enquanto o lentivírus pode se integrar ao genoma de qualquer célula que encontre15, a integração genômica eficiente do retrovírus necessita da proliferação das células-alvo16. Os vetores adenoviral e AAV não se integram ao genoma das células infectadas e, portanto, expressam apenas transitoriamente o gene de interesse17,18. Essa característica pode ser uma vantagem quando o gene de interesse precisa ser expresso por apenas um curto período de tempo, como Cre, para excluir um gene supressor de tumor floxed.
Lentivírus, adenovírus e AAV infectam quaisquer células de camundongo que encontrarem. Mas como o epitélio luminal é amplamente isolado da camada basal subjacente, que é separada do estroma pela membrana basal, a injeção intraductal limita a infecção em grande parte às células epiteliais luminais, a célula primária de origem do câncer de mama. Dentro dessa camada epitelial luminal, existem também subtipos celulares distintos, incluindo células-tronco, células progenitoras e vários grupos de células diferenciadas. Para infectar subgrupos celulares específicos dentro da população de células luminais, pode ser usada a tecnologia TVA, com a qual vetores RCAS derivados do vírus da leucose aviária5,10 ou vetores lentivirais pseudotipados11 infectam seletivamente as células que expressam TVA em camundongos portadores de um transgene tva sob o controle de um promotor específico do tipo celular, como um promotor ativo apenas em células-tronco 6 ou certos progenitores 6, 7 ou células alveolares8 ou células ativas da via Wnt9.
Este protocolo apresenta a técnica de introdução de genes de interesse em células epiteliais mamárias através da injeção intraductal de um vetor viral. A detecção da expressão dos genes introduzidos e as lesões e tumores hiperplásicos resultantes são então demonstrados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artigo demonstra a técnica de injeção intraductal viral para introdução de genes em células epiteliais mamárias de camundongos para modelagem de câncer de mama esporádico. Normalmente, camundongos de pelo menos 5 semanas ou mais são injetados para que o processo oncogênico comece depois que a glândula mamária é desenvolvida. Além disso, a abertura do mamilo de camundongos com menos de 5 semanas de idade é muitas vezes muito pequena para injeção. Por outro lado, os mamilos de camundongos muito velho…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Gary Chamness por seus comentários úteis sobre este manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Defesa (DOD) CDMRP BC191649 (YL) e BC191646 (YL), bem como pelo National Institutes of Health (NIH) CA271498 (YL). Os autores gostariam de agradecer ao Breast Center Pathology Core Facility apoiado pelo SPORE P50CA186784, e ao Cytometry and Cell Sorting Core apoiado pelo CPRIT-RP180672, NIH CA125123 e RR024574 com a assistência de Joel M. Sederstrom.
Materials
| Anti-HA antibody | Covance | MMS-101P | Dilution: 1 : 1000 |
| Artificial Tears | Covetrus | NDC 11695-0832-1 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525 | microwave radiation for 45 seconds at power high of 1250W microwave oven |
| FACSCantoII | BD Biosciences | V96100899 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | |
| FUCGW lenti-virus | Self-made | N/A | See reference # 12 |
| FVB/N | The Jackson Laboratory | JAX:001800 | |
| Hamilton needle | Hamilton | 91033 | autoclaved |
| Hamilton syringe | Hamilton | 201000 | autoclaved |
| LED magnifying lamp | Intertek | 3165273 | |
| Micro dissection spring scissor | Roboz | RS-5621 | autoclaved |
| MMTV-tva | Self-made | See reference # 10 | |
| RCAS-Neu (HA) | Self-made | N/A | See reference # 10 |
| Rodent Comboanesthetic III | Veterinary Pharmacy | Veterinary prescription | 37.6 mg/mL ketamine, 1.92 mg/mL xylazine, and 0.38 mg/mL acepromazine |
Riferimenti
- Nguyen, D. -. A., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C., Ip, M. M., Asch, B. B. . Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. Eds Margot. , 259-270 (2000).
- Gordon, J. W., Ruddle, F. H. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).
- Costantini, F., Lacy, E. Introduction of a rabbit beta-globin gene into the mouse germ line. Nature. 294 (5836), 92-94 (1981).
- Brinster, R. L., et al. Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into eggs. Cell. 27 (1), 223-231 (1981).
- Du, Z., Li, Y. RCAS-TVA in the mammary gland: an in vivo oncogene screen and a high fidelity model for breast transformation. Cell Cycle. 6 (7), 823-826 (2007).
- Bu, W., et al. Mammary precancerous stem and non-stem cells evolve into cancers of distinct subtypes. Ricerca sul cancro. 79 (1), 61-71 (2019).
- Bu, W., et al. Keratin 6a marks mammary bipotential progenitor cells that can give rise to a unique tumor model resembling human normal-like breast cancer. Oncogene. 30 (43), 4399-4409 (2011).
- Haricharan, S., et al. Contribution of an alveolar cell of origin to the high-grade malignant phenotype of pregnancy-associated breast cancer. Oncogene. 33 (50), 5729-5739 (2014).
- Bu, W., Zhang, X., Dai, H., Huang, S., Li, Y. Mammary cells with active Wnt signaling resist ErbB2-induced tumorigenesis. PLoS One. 8 (11), 78720 (2013).
- Du, Z., et al. Introduction of oncogenes into mammary glands in vivo with an avian retroviral vector initiates and promotes carcinogenesis in mouse models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17396-17401 (2006).
- Siwko, S. K., et al. Lentivirus-mediated oncogene introduction into mammary cells in vivo induces tumors. Neoplasia. 10 (7), 653-662 (2008).
- Bu, W., Xin, L., Toneff, M., Li, L., Li, Y. Lentivirus vectors for stably introducing genes into mammary epithelial cells in vivo. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 14 (4), 401-404 (2009).
- Russell, T. D., et al. Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo. Journal of Virology. 77 (10), 5801-5809 (2003).
- Wagner, S., Thresher, R., Bland, R., Laible, G. Adeno-associated-virus-mediated transduction of the mammary gland enables sustained production of recombinant proteins in milk. Scientific Reports. 5, 15115 (2015).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . Retroviruses. , (1997).
- Mitani, K., Kubo, S. Adenovirus as an integrating vector. Current Gene Therapy. 2 (2), 135-144 (2002).
- McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annual Review of Genetics. 38, 819-845 (2004).
- Bu, W., Li, Y. Intraductal injection of lentivirus vectors for stably introducing genes into rat mammary epithelial cells in vivo. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 389-396 (2020).
- Dong, J., et al. Genetic manipulation of individual somatic mammary cells in vivo reveals a master role of STAT5a in inducing alveolar fate commitment and lactogenesis even in the absence of ovarian hormones. Biologia dello sviluppo. 346 (2), 196-203 (2010).
- Haricharan, S., et al. Mechanism and preclinical prevention of increased breast cancer risk caused by pregnancy. eLife. 2, 00996 (2013).
- Reddy, J. P., et al. Defining the ATM-mediated barrier to tumorigenesis in somatic mammary cells following ErbB2 activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3728-3733 (2010).
- Dong, J., et al. The PR status of the originating cell of ER/PR-negative mouse mammary tumors. Oncogene. 35 (31), 4149-4154 (2016).
- Young, A., et al. Targeting the pro-survival protein BCL-2 to prevent breast cancer. Cancer Prevention Research. 15 (1), 3-10 (2022).
- Schlimgen, R., et al. Risks associated with lentiviral vector exposures and prevention strategies. Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).
- Holloway, K. R., et al. Krt6a-positive mammary epithelial progenitors are not at increased vulnerability to tumorigenesis initiated by ErbB2. PLoS One. 10 (1), 0117239 (2015).
- Holloway, K. R., et al. Targeting oncogenes into a defined subset of mammary cells demonstrates that the initiating oncogenic mutation defines the resulting tumor phenotype. International Journal of Biological Sciences. 12 (4), 381-388 (2016).
- Hein, S. M., et al. Luminal epithelial cells within the mammary gland can produce basal cells upon oncogenic stress. Oncogene. 35 (11), 1461-1467 (2015).
- Annunziato, S., et al. In situ CRISPR-Cas9 base editing for the development of genetically engineered mouse models of breast cancer. EMBO Journal. 39 (5), 102169 (2020).
- Annunziato, S., et al. Modeling invasive lobular breast carcinoma by CRISPR/Cas9-mediated somatic genome editing of the mammary gland. Genes & Development. 30 (12), 1470-1480 (2016).
