В естественных условиях Доставка генов в эпителиальные клетки молочной железы мыши посредством внутрипротоковой инъекции молочной железы

Summary

Настоящий протокол описывает внутрипротоковую инъекцию вирусных векторов через соску для доставки интересующих генов в эпителиальные клетки молочной железы.

Abstract

Молочные железы мыши состоят из протоковых деревьев, которые выстланы эпителиальными клетками и имеют по одному отверстию на кончике каждого соска. Эпителиальные клетки играют важную роль в функционировании молочной железы и являются источником большинства опухолей молочной железы. Введение интересующих генов в эпителиальные клетки молочной железы мыши является важным шагом в оценке функции генов в эпителиальных клетках и создании моделей опухолей молочной железы мышей. Эта цель может быть достигнута путем внутрипротоковой инъекции вирусного вектора, несущего интересующие гены, в протоковое дерево молочной железы мыши. Введенный вирус впоследствии заражает эпителиальные клетки молочной железы, привнося интересующие гены. Вирусный вектор может быть лентивиральным, ретровирусным, аденовиральным или аденовирус-ассоциированным вирусом (AAV). Это исследование демонстрирует, как интересующий ген доставляется в эпителиальные клетки молочной железы посредством внутрипротоковой инъекции вирусного вектора в грудную клетку мыши. Лентивирус, несущий GFP , используется для демонстрации стабильной экспрессии доставленного гена, а ретровирус, несущий Erbb2 (HER2 / Neu), используется для демонстрации онкоген-индуцированных атипичных гиперпластических поражений и опухолей молочной железы.

Introduction

Эпителиальные клетки молочных желез играют важную роль в функционировании этих желез и являются основной клеткой происхождения рака молочной железы. Исследования биологии молочной железы и онкогенеза часто требуют доставки интересующих генов в эти клетки. Каждая молочная железа мыши состоит из протокового дерева, выстланного эпителиальными клетками, с одним отверстием на кончике соска. Эта структура делает эпителиальные клетки молочной железы легко доступными для вирусных векторов, которые могут быть доставлены в просвет протокового дерева посредством внутрипротоковой инъекции¹.

Техника внутрипротоковой инъекции молочной железы первоначально использовалась для гораздо более крупных животных, таких как козы, кролики и крысы¹. Для гораздо более мелких животных, таких как мыши, внутрипротоковая инъекция требует много тонких инструментов и больше практики операторов. Существует два подхода к внутрипротоковой инъекции мышей. Одним из них является инъекция вверх по соску¹. Другим является прямая инъекция в первичный проток молочной железы #3 или #4 после хирургического воздействия¹. Поскольку первый является неинвазивным и более быстрым, как только оператор будет хорошо обучен, этот метод используется чаще и будет подробно описан в этой статье.

По сравнению с широко используемыми традиционными моделями трансгенных мышей, в которых интересующий ген вводится на стадии оплодотворенных яйцеклеток посредством микроинъекции ^2,3,4, доставка генов с помощью метода внутрипротоковой инъекции вируса имеет много преимуществ^, в том числе: (1) позволяет избежать трудоемкого процесса создания трансгенной линии мыши для каждого интересующего гена; (2) это позволяет избежать потенциального нарушения нормального развития молочных желез, вызванного интересующим геном; (3) он вводит интересующий ген в любое желаемое время после рождения; (4) он может легко вводить более одного интересующего гена; (5) он лучше имитирует естественный онкогенный процесс, потому что инфицированные и, следовательно, несущие онкоген клетки, окружены нормальными клетками; и (6) в сочетании с технологией TVA (опухолевый вирус А, поверхностный белок птичьей клетки и рецептор для ретровирусного вектора^RCAS) 5 интересующий ген может быть введен в конкретную клеточную популяцию для изучения клеточного происхождения онкогенеза и для проведения анализов отслеживания клеточных линий в молочных железах 6,7,8^{, 9}.

Любые векторы, полученные из ретровируса 10, лентивируса 11,12, аденовируса 13 и аденовирус-ассоциированного вируса (AAV)^14, могут быть использованы для внутрипротоковой доставки генетических материалов. Ретровирусные и лентивирусные векторы постоянно интегрируются в геном хозяина; Таким образом, они стабильно вводят интересующие гены в эпителиальные клетки молочной железы. В то время как лентивирус может интегрироваться в геном любой клетки, с которой он сталкивается¹⁵, эффективная геномная интеграция ретровируса требует пролиферации^{клеток-мишеней 16}. Аденовирусные и AAV-векторы не интегрируются в геном инфицированных клеток и, следовательно, лишь временно экспрессируют интересующий ген^17,18. Эта особенность может быть преимуществом, когда интересующий ген должен быть экспрессирован только в течение короткого промежутка времени, например, Cre, для удаления флоксированного гена-супрессора опухоли.

Лентивирус, аденовирус и AAV заражают любые клетки мыши, с которыми они сталкиваются. Но поскольку просветный эпителий в значительной степени изолирован от нижележащего базального слоя, который дополнительно отделен от стромы базальной мембраной, внутрипротоковая инъекция ограничивает инфекцию в основном клетками просветного эпителия, первичной клеткой происхождения рака молочной железы. В этом эпителиальном слое просвета также существуют различные подтипы клеток, включая стволовые клетки, клетки-предшественники и несколько групп дифференцированных клеток. Для заражения специфических клеточных подмножеств в популяции люминальных клеток может быть использована технология TVA, с помощью которой RCAS-векторы^5,10, полученные из вируса лейкоза птиц, или псевдотипированные лентивирусные векторы ¹¹ избирательно инфицируют клетки, экспрессирующие TVA у мышей, несущих трансген tva под контролем промотора, специфичного для клеточного типа, такого как промотор, который активен только в стволовых клетках 6 или определенных предшественниках ^{6, 7} или альвеолярные клетки⁸ или активные клетки Wnt-пути⁹.

В этом протоколе представлена методика введения интересующих генов в эпителиальные клетки молочной железы путем внутрипротоковой инъекции вирусного вектора. Затем демонстрируется обнаружение экспрессии введенных генов и возникающих в результате гиперпластических поражений и опухолей.

Protocol

Все процедуры с использованием мышей были выполнены в соответствии с протоколом по уходу за животными, утвержденным Комитетом по уходу за животными и их использованию. Для настоящего исследования были использованы 9-12-недельные самки мышей FVB/N или MMTV-tva. Мыши были получены коммерче…

Representative Results

Здесь представлены репрезентативные данные, демонстрирующие успешную внутрипротоковую инъекцию, успешную вирусную инфекцию и влияние доставленных генов на онкогенез молочной железы. Количество вводимого вируса должно быть адаптировано к цели каждого эксперимента. Чтобы проиллюстр…

Discussion

В данной статье демонстрируется методика вирусной внутрипротоковой инъекции для введения генов в эпителиальные клетки молочной железы мыши для моделирования спорадического рака молочной железы. Обычно мышам не менее 5 недель и старше вводят, чтобы онкогенный процесс начался после ра…

Materials

Anti-HA antibody	Covance	MMS-101P	Dilution: 1 : 1000
Artificial Tears	Covetrus	NDC 11695-0832-1
Bromophenol blue	Sigma	B5525	microwave radiation for 45 seconds at power high of 1250W microwave oven
FACSCantoII	BD Biosciences	V96100899
Fluorescent stereomicroscope	Leica	MZ16 FA
FUCGW lenti-virus	Self-made	N/A	See reference # 12
FVB/N	The Jackson Laboratory	JAX:001800
Hamilton needle	Hamilton	91033	autoclaved
Hamilton syringe	Hamilton	201000	autoclaved
LED magnifying lamp	Intertek	3165273
Micro dissection spring scissor	Roboz	RS-5621	autoclaved
MMTV-tva	Self-made		See reference # 10
RCAS-Neu (HA)	Self-made	N/A	See reference # 10
Rodent Comboanesthetic III	Veterinary Pharmacy	Veterinary prescription	37.6 mg/mL ketamine, 1.92 mg/mL xylazine, and 0.38 mg/mL acepromazine