In vivo Genleverans till musbröstepitelceller genom bröst intraduktal injektion

Summary

Detta protokoll beskriver intraduktal injektion av virala vektorer via spenen för att leverera gener av intresse till bröstepitelcellerna.

Abstract

Musbröstkörtlar består av duktala träd, som är fodrade av epitelceller och har en öppning vid spetsen av varje bröstvårta. Epitelcellerna spelar en viktig roll i bröstkörtelfunktionen och är ursprunget till de flesta brösttumörer. Att introducera gener av intresse i musbröstepitelceller är ett kritiskt steg för att utvärdera genfunktion i epitelceller och generera musbrösttumörmodeller. Detta mål kan uppnås genom intraduktal injektion av en viral vektor som bär generna av intresse i musens bröstduktala träd. Det injicerade viruset infekterar därefter bröstepitelceller, vilket ger in generna av intresse. Den virala vektorn kan vara lentiviral, retroviral, adenoviral eller adenovirusassocierad viral (AAV). Denna studie visar hur en gen av intresse levereras in i bröstepitelceller genom intraduktal injektion av en virusvektor i musbröst. Ett lentivirus som bär GFP används för att visa stabilt uttryck av en levererad gen, och ett retrovirus som bär Erbb2 (HER2 / Neu) används för att visa onkogeninducerade atypiska hyperplastiska lesioner och brösttumörer.

Introduction

Epitelceller i bröstkörtlar spelar en viktig roll i funktionen av dessa körtlar och är den viktigaste ursprungscellen för bröstcancer. Studier av bröstkörtelbiologi och tumörgenes behöver ofta leverans av gener av intresse till dessa celler. Varje musbröstkörtel består av ett duktalt träd kantat av epitelceller med en enda öppning vid spetsen av bröstvårtan. Denna struktur gör bröstepitelcellerna lättillgängliga för virala vektorer, som kan levereras in i lumen i ett duktalt träd via intraduktal injektion¹.

Tekniken för bröst intraduktal injektion användes ursprungligen för mycket större djur som getter, kaniner och råttor¹. För ett mycket mindre djur som möss behöver intraduktal injektion många känsliga verktyg och fler metoder från operatörerna. Det finns två metoder för mus intraduktal injektion. En är up-the-pen-injektion¹. En annan är den direkta injektionen av primärkanalen av # 3 eller # 4 bröstkörtel efter kirurgisk exponering¹. Eftersom den första är icke-invasiv och snabbare när operatören har blivit välutbildad, används denna teknik oftare och kommer att beskrivas i detalj i den här artikeln.

Jämfört med de allmänt använda traditionella transgena musmodellerna, där genen av intresse introduceras vid scenen av befruktade ägg genom mikroinjektion ^2,3,4, har genleverans genom den intraduktala virusinjektionsmetoden många fördelar^, inklusive: (1) det undviker den tidskrävande processen att göra en transgen muslinje för varje gen av intresse; (2) det undviker potentiell försämring av den normala utvecklingen av bröstkörtlar som åläggs av genen av intresse; (3) Den introducerar genen av intresse vid önskad tidpunkt efter födseln. (4) det kan lätt samintroducera mer än en gen av intresse; (5) det efterliknar bättre den naturliga tumörframkallande processen eftersom de infekterade och därmed onkogenbärande cellerna är omgivna av normala celler; och (6) i kombination med TVA-tekniken (tumörvirus A, ett protein på fågelcellytan och receptorn för retrovirus RCAS-vektor)⁵ kan genen av intresse införas i en specifik cellpopulation för att studera cellursprunget till tumörgenes och för att utföra cellinjespårningsanalyser i bröstkörtlarna 6,7,8^{, 9}.

Alla vektorer som härrör från retrovirus¹⁰, lentivirus ^11,12, adenovirus¹³ och adenovirusassocierat virus (AAV)¹⁴ kan användas för intraduktal tillförsel av genetiskt material. Retrovirus och lentivirus vektorer integreras permanent i värdgenomet; Således introducerar de gener av intresse stabilt i bröstepitelceller. Medan lentivirus kan integreras i genomet hos vilken cell som helst som den möter¹⁵, behöver den effektiva genomiska integrationen av retrovirus spridningen av målcellerna¹⁶. De adenovirala och AAV-vektorerna integreras inte i genomet hos infekterade celler och uttrycker därför endast tillfälligt genen av intresse^17,18. Denna funktion kan vara en fördel när genen av intresse behöver uttryckas under endast en kort tid, såsom Cre, för att radera en floxed tumörsuppressorgen.

Lentivirus, adenovirus och AAV infekterar alla musceller de stöter på. Men eftersom luminalt epitel till stor del är isolerat från det underliggande basalskiktet, som vidare separeras från stroma av basalmembranet, begränsar intraduktal injektion infektionen till stor del till luminala epitelceller, den primära ursprungscellen för bröstcancer. Inom detta luminala epitelskikt finns det också distinkta cellsubtyper, inklusive stamceller, stamceller och flera grupper av differentierade celler. För att infektera specifika cellundergrupper inom luminalcellspopulationen kan TVA-tekniken användas, med vilken RCAS-vektorerna^5,10 eller pseudotypade lentivirala vektorer ¹¹ selektivt infekterar de celler som uttrycker TVA hos möss som bär på en tva-transgen under kontroll av en celltypspecifik promotor, såsom en promotor som endast är aktiv i stamceller 6 eller vissa stamceller^{6, 7} eller alveolära celler⁸ eller Wnt-väg aktiva celler⁹.

Detta protokoll presenterar tekniken för att införa gener av intresse i bröstepitelceller genom intraduktal injektion av en viral vektor. Detektion av uttryck av de införda generna och de resulterande hyperplastiska lesionerna och tumörerna demonstreras sedan.

Protocol

Alla procedurer med möss utfördes i enlighet med det godkända djurprotokollet från Institutional Animal Care and Use Committee. För den aktuella studien användes 9-12 veckor gamla FVB / N eller MMTV-tva kvinnliga möss. Mössen erhölls kommersiellt eller egentillverkade (se materialförteckning). Lenti-EGFP (FUCGW) och RCAS-Erbb2 (Neu) virus användes. Virusberedning och titerbestämning utfördes enligt de tidigare publicerade rapporterna10,12<su…

Representative Results

Representativa data presenteras här för att visa framgångsrik intraduktal injektion, framgångsrik virusinfektion och effekten av de levererade generna på brösttumörgenesen. Mängden virus som injiceras måste skräddarsys för syftet med varje experiment. För att illustrera hur omfattande bröstkanalträdet kan infekteras behöver en stor mängd virusbärande gener som kan avbildas, till exempel GFP, användas. Å andra sidan, för att efterlikna den naturliga spontana tumörgenesen, måste en liten mängd virus …

Discussion

Denna artikel visar den virala intraduktala injektionstekniken för att införa gener i musbröstepitelceller för modellering av sporadisk bröstcancer. Vanligtvis injiceras möss på minst 5 veckor eller äldre så att den onkogena processen börjar efter att bröstkörteln har utvecklats. Dessutom är bröstvårtöppningen hos möss yngre än 5 veckor ofta för liten för injektion. Å andra sidan degenereras ibland bröstvårtorna hos mycket gamla möss, och transektion kan misslyckas med att avslöja en duktal öppn…

Materials

Anti-HA antibody	Covance	MMS-101P	Dilution: 1 : 1000
Artificial Tears	Covetrus	NDC 11695-0832-1
Bromophenol blue	Sigma	B5525	microwave radiation for 45 seconds at power high of 1250W microwave oven
FACSCantoII	BD Biosciences	V96100899
Fluorescent stereomicroscope	Leica	MZ16 FA
FUCGW lenti-virus	Self-made	N/A	See reference # 12
FVB/N	The Jackson Laboratory	JAX:001800
Hamilton needle	Hamilton	91033	autoclaved
Hamilton syringe	Hamilton	201000	autoclaved
LED magnifying lamp	Intertek	3165273
Micro dissection spring scissor	Roboz	RS-5621	autoclaved
MMTV-tva	Self-made		See reference # 10
RCAS-Neu (HA)	Self-made	N/A	See reference # 10
Rodent Comboanesthetic III	Veterinary Pharmacy	Veterinary prescription	37.6 mg/mL ketamine, 1.92 mg/mL xylazine, and 0.38 mg/mL acepromazine