In vivo Genlevering i musepitelceller gjennom intraduktal injeksjon

Summary

Den nåværende protokollen beskriver intraduktal injeksjon av virale vektorer via smokken for å levere gener av interesse inn i brystepitelcellene.

Abstract

Mus brystkjertler består av duktale trær, som er foret av epitelceller og har en åpning på spissen av hver brystvorte. Epitelcellene spiller en viktig rolle i brystkjertelfunksjonen og er opprinnelsen til de fleste brystsvulster. Innføring av gener av interesse i musepitelceller er et kritisk skritt i evaluering av genfunksjon i epitelceller og generering av mus mammary tumormodeller. Dette målet kan oppnås gjennom intraduktal injeksjon av en viral vektor som bærer gener av interesse inn i musens mammary ductal tree. Det injiserte viruset infiserer deretter brystepitelceller, og bringer inn gener av interesse. Virusvektoren kan være lentiviral, retroviral, adenoviral eller adenovirusassosiert viral (AAV). Denne studien demonstrerer hvordan et gen av interesse leveres inn i brystepitelceller gjennom intraduktal injeksjon av en viral vektor hos mus. Et lentivirus som bærer GFP brukes til å vise stabilt uttrykk for et levert gen, og et retrovirus som bærer Erbb2 (HER2 / Neu) brukes til å demonstrere onkogeninduserte atypiske hyperplastiske lesjoner og brysttumorer.

Introduction

Epitelceller i brystkjertlene spiller en viktig rolle i funksjonen til disse kjertlene og er den viktigste opprinnelsescellen til brystkreft. Studier av brystkjertelbiologi og tumorigenese trenger ofte levering av gen (er) av interesse i disse cellene. Hver mus brystkjertel består av et duktalt tre foret av epitelceller med en enkelt åpning på spissen av brystvorten. Denne strukturen gjør brystepitelcellene lett tilgjengelige for virale vektorer, som kan leveres inn i lumen i et duktaltre via intraduktal injeksjon¹.

Teknikken med intraduktal injeksjon av bryst ble opprinnelig brukt til mye større dyr som geiter, kaniner og rotter¹. For et mye mindre dyr som mus trenger intraduktal injeksjon mange delikate verktøy og mer praksis fra operatørene. Det er to tilnærminger for intraduktal injeksjon med mus. Den ene er up-the-teat injeksjon¹. En annen er direkte injeksjon av den primære kanalen av # 3 eller # 4 brystkjertel etter kirurgisk eksponering¹. Siden den første er ikke-invasiv og raskere når operatøren har blitt godt trent, er denne teknikken mer vanlig og vil bli beskrevet i detalj i denne artikkelen.

Sammenlignet med de mye brukte tradisjonelle transgene musemodellene, der genet av interesse blir introdusert på scenen av befruktede egg gjennom mikroinjeksjon ^2,3,4, har genlevering gjennom den intraduktale virusinjeksjonsmetoden mange fordeler^, inkludert: (1) det unngår den tidkrevende prosessen med å lage en transgen muselinje for hvert gen av interesse; (2) det unngår potensiell svekkelse på normal utvikling av brystkjertler pålagt av genet av interesse; (3) det introduserer genet av interesse til enhver ønsket tid etter fødselen; (4) det kan lett introdusere mer enn ett gen av interesse; (5) det etterligner bedre den naturlige tumorigene prosessen fordi de infiserte og dermed onkogenbærende cellene er omgitt av normale celler; og (6) i kombinasjon med TVA (tumorvirus A, et aviært celleoverflateprotein og reseptoren for retrovirus RCAS-vektor) teknologi⁵, kan genet av interesse innføres i en spesifikk cellepopulasjon for å studere celleopprinnelsen til tumorigenese og å gjennomføre cellelinjesporingsanalyser i brystkjertlene 6,7,8^{, 9}.

Alle vektorer avledet fra retrovirus¹⁰, lentivirus 11,12^, adenovirus¹³ og adenovirusassosiert virus (AAV)¹⁴ kan brukes til intraduktal levering av genetisk materiale. Retrovirus- og lentivirusvektorer integreres permanent i vertsgenomet; Dermed introduserer de gener av interesse stabilt i brystepitelceller. Mens lentivirus kan integreres i genomet til en hvilken som helst celle den møter¹⁵, trenger effektiv genomisk integrasjon av retrovirus spredning av målcellene¹⁶. Adenovirale og AAV-vektorer integreres ikke i genomet til infiserte celler og uttrykker derfor bare forbigående genet av interesse^17,18. Denne funksjonen kan være en fordel når genet av interesse må uttrykkes for bare en kort tidsperiode, for eksempel Cre, for å slette et floxed tumor suppressor gen.

Lentivirus, adenovirus og AAV infiserer alle museceller de møter. Men siden luminalepitel i stor grad er isolert fra det underliggende basallaget, som videre separeres fra stroma av kjellermembranen, begrenser intraduktal injeksjon infeksjonen i stor grad til luminale epitelceller, den primære opprinnelsescellen til brystkreft. Innenfor dette luminale epitellaget er det også forskjellige celleundertyper, inkludert stamceller, stamceller og flere grupper av differensierte celler. For å infisere spesifikke celleundergrupper i luminalcellepopulasjonen, kan TVA-teknologien brukes, med hvilken aviær leukosevirus-avledede RCAS-vektorer^5,10 eller pseudotype lentivirale vektorer¹¹ selektivt infiserer cellene som uttrykker TVA hos mus som bærer et tva-transgen under kontroll av en celletypespesifikk promotor, for eksempel en promotor som bare er aktiv i stamceller 6 eller visse forfedre ^{6, 7} eller alveolære celler⁸ eller Wnt-pathway aktive celler⁹.

Denne protokollen presenterer teknikken for å introdusere gener av interesse i brystepitelceller gjennom intraduktal injeksjon av en viral vektor. Påvisning av ekspresjon av de introduserte gener og de resulterende hyperplastiske lesjoner og svulster blir deretter demonstrert.

Protocol

Alle prosedyrer med mus ble utført i samsvar med dyreprotokollen godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee. For denne studien ble 9-12 uker gamle FVB / N eller MMTV-tva kvinnelige mus brukt. Musene ble oppnådd kommersielt eller selvfremstilt (se materialtabell). Lenti-EGFP (FUCGW) og RCAS-Erbb2 (Neu) virus ble brukt. Virusklargjøring og titerbestemmelse ble utført etter tidligere publiserte rapporter10,12</s…

Representative Results

Representative data presenteres her for å demonstrere vellykket intraduktal injeksjon, vellykket virusinfeksjon og virkningen av de leverte gener på brysttumorigenese. Mengden virus som injiseres må skreddersys til formålet med hvert eksperiment. For å illustrere hvor omfattende brystgangstreet kan infiseres, må en stor mengde virusbærende gener som kan avbildes, for eksempel GFP, brukes. På den annen side, for å etterligne den naturlige spontane tumorigenese, må en liten mengde virus som bærer et onkogen bruk…

Discussion

Denne artikkelen demonstrerer viral intraduktal injeksjonsteknikk for å introdusere gener i musepitelceller for modellering av sporadisk brystkreft. Vanligvis injiseres mus på minst 5 uker eller eldre slik at den onkogene prosessen starter etter at brystkjertelen er utviklet. Dessuten er brystvorteåpningen til mus yngre enn 5 uker gammel ofte for liten til injeksjon. På den annen side blir brystvortene til svært gamle mus noen ganger degenerert, og transeksjon kan ikke avsløre en duktalåpning. Det er også viktig …

Materials

Anti-HA antibody	Covance	MMS-101P	Dilution: 1 : 1000
Artificial Tears	Covetrus	NDC 11695-0832-1
Bromophenol blue	Sigma	B5525	microwave radiation for 45 seconds at power high of 1250W microwave oven
FACSCantoII	BD Biosciences	V96100899
Fluorescent stereomicroscope	Leica	MZ16 FA
FUCGW lenti-virus	Self-made	N/A	See reference # 12
FVB/N	The Jackson Laboratory	JAX:001800
Hamilton needle	Hamilton	91033	autoclaved
Hamilton syringe	Hamilton	201000	autoclaved
LED magnifying lamp	Intertek	3165273
Micro dissection spring scissor	Roboz	RS-5621	autoclaved
MMTV-tva	Self-made		See reference # 10
RCAS-Neu (HA)	Self-made	N/A	See reference # 10
Rodent Comboanesthetic III	Veterinary Pharmacy	Veterinary prescription	37.6 mg/mL ketamine, 1.92 mg/mL xylazine, and 0.38 mg/mL acepromazine