Questo protocollo descrive l'isolamento dei macrofagi interstiziali polmonari (IM) e il loro trasferimento adottivo dopo stimolazione IL-33 degli alveoli polmonari in un modello murino, che può facilitare lo studio in vivo della fibrosi polmonare idiopatica (IPF).
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Articolo metodologico
Trasferimento adottivo di macrofagi stimolati da IL-33 in modelli murini indotti da bleomicina per studiare il loro effetto sulla fibrosi polmonare idiopatica in vivo
* These authors contributed equally
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Sommario
Abstract
La risposta infiammatoria causata da lesioni polmonari precoci è una delle cause importanti dello sviluppo della fibrosi polmonare idiopatica (IPF), che è accompagnata dall'attivazione di cellule infiammatorie come macrofagi e neutrofili, nonché dal rilascio di fattori infiammatori tra cui TNF-α, IL-1β e IL-6. È noto che l'infiammazione precoce causata dall'attivazione dei macrofagi interstiziali polmonari (IM) in risposta alla stimolazione di IL-33 svolge un ruolo vitale nel processo patologico dell'IPF. Questo protocollo descrive il trasferimento adottivo di IMs stimolati da IL-33 nei polmoni dei topi per studiare lo sviluppo dell'IPF. Coinvolge l'isolamento e la coltura di IM primari dai polmoni del topo ospite, seguito dal trasferimento adottivo di IM stimolati negli alveoli di topi riceventi IPF indotti da bleomicina (BLM) (che sono stati precedentemente impoveriti di macrofagi alveolari dal trattamento con liposomi clodronati) e la valutazione patologica di quei topi. I risultati rappresentativi mostrano che il trasferimento adottivo di macrofagi stimolati da IL-33 aggrava la fibrosi polmonare nei topi, suggerendo che l'istituzione dell'esperimento di trasferimento adottivo dei macrofagi è un buon mezzo tecnico per studiare la patologia dell'IPF.
Introduzione
La fibrosi polmonare idiopatica (IPF) è una malattia infiammatoria polmonare diffusa causata da molti fattori1. Nel microambiente delle citochine della risposta immunitaria Th1 e Th2, i macrofagi possono essere polarizzati in macrofagi classicamente attivati (M1) e alternativamente attivati macrofagi (M2). I lipopolisaccaridi (LPS) o la citochina IFN- γ inducono i macrofagi M1 a polarizzarsi e produrre citochine pro-infiammatorie, tra cui iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α e IL-12. Al contrario, le citochine di tipo II IL-4 e IL-13 guidano la polarizzazione dei macrofagi M2, che possono produrre diversi fattori promotori della crescita dei fibroblasti, co....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico sperimentale per il benessere degli animali dell'Università di Jiangnan (JN n. 20211130m1720615[501]).
NOTA: In totale, in questo studio sono stati utilizzati 10 topi maschi C57BL / 6 di età compresa tra 6-8 settimane e del peso di 20-25 g. I tre gruppi sperimentali nello studio includevano tre topi riceventi ciascuno e un topo ospite è stato utilizzato per l'isolamento IM.
1. Esaurimento dei macrofagi po....
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Risultati
Il protocollo utilizzato qui è riepilogato nel diagramma di flusso nella Figura 1. L'inalazione di liposomi clodronati attraverso il naso (Figura 2) è stata utilizzata per esaurire i macrofagi polmonari dei topi adulti C57BL / 6, e questo ha prodotto un buon modello murino ricevente. Gli IM polmonari sono stati isolati da un altro topo non trattato (ospite) (Figura 3A,B) e coltivati in vitro. I macrofagi i.......
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Discussione
Questo studio fornisce un metodo efficace per esaurire, isolare, coltivare e trasferire i macrofagi, che può aiutare a studiare i meccanismi della fibrosi polmonare nei topi. Esistono molti metodi per l'esaurimento dei macrofagi di topo, come la somministrazione tracheale, l'iniezione della vena caudale e l'inalazione nasale11. Questo studio ha ottimizzato il metodo di inalazione nasale, che è semplice da utilizzare e può effettivamente esaurire i macrofagi polmonari 8.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono il tema speciale della gestione del laboratorio dell'Università di Jiangnan: costruzione della biblioteca digitale delle fette basata su campioni patologici (JDSYS202223) e la National Natural Science Foundation of China (81800065).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life technologies Biotecnologia, USA | 1508012 | |
| Ago a permanenza arteriosa | B Braun Melsingen AG, Germania | 21G15G8393 | |
| BD Accuri C6 Plus | Becton Dickinson, USA | ||
| Bleomicina | Biotang, USA | Ab9465 | |
| Incubatore ad anidride carbonica | Thermo Forma, USA | Thermo Forma370 | |
| CD11b | R& D Systems, USA | 1124F | |
| CD11c | R& D Systems, USA | N418 | |
| Piatto di coltura cellulare | Thermo Forma, USA | 174926 | |
| Liposomi di clodronato. | Liposomi di clodronato, Paesi Bassi | CI-150-150 | |
| Collagenasi A | Sigma-Aldrich, USA | 10103578001 | |
| F4/80 | R & D Systems, USA | 521204 | |
| Filtro cellulare falco | Becton, Dickinson and Company, USA | 352340 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Tecnologie per la vita, USA | 1047571 | |
| Ematossilina Eosin | Nanjing Jiancheng Technology, Cina | 06-570 | |
| LightCycler 480 PCR sistema di rilevamento | Roche, USA | ||
| Fattore ricombinante murino IL-33 | Peprotech, USA | 210-33 | |
| Microscopio Nikon | Nikon Corporation, Giappone | 941185 | |
| Penicillina, streptomicina | Life technologies, USA | 877113 | |
| Fosfato tampone (PBS) | Guangdong Huankai Microbial Technology,Cina | 1535882 | |
| tampone di lisi RBC | Beyotime Biotechnology Company,Cina | C3702 | |
| RNA Isolater | Vazyme company,Cina | R401-01-AA | Reagente di estrazione dell'RNA totale |
| RWD Macchina per anestesia per inalazione | Rayward Life Technology,Cina | R500 | |
| Paraffina semiautomatica affettatrice | Leica, Germania | LeicaRM2245 | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara, Giappone | 410800 | |
| Tripsina 0,25% | Life Technologies, USA | 1627172 |
Riferimenti
- Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment. Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).
- Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. Microarray an....
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
An erratum was issued for: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo. The Protocol section was updated.
Step 2.1 of the Protocol was updated from:
Anesthetize the host mouse with 3% isoflurane, and then euthanize it by cervical dislocation. Disinfect the skin of the euthanized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue
to:
Anesthetize the host mouse with an intraperitoneal injection of Ketamine (120 mg/kg) and Xylazine (16 mg/kg). Confirm the depth of anesthesia via loss of the toe pinch reflex. Apply veterinary ointment to both eyes to prevent dryness under anesthesia. Then, disinfect the skin of the anesthetized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue
