वर्तमान प्रोटोकॉल प्रवाह साइटोमेट्री या स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर का उपयोग करके फ्लोरोजेनिक सब्सट्रेट के माध्यम से कैसपेज़ गतिविधि को मापने के लिए दो तरीकों का वर्णन करता है।
सिस्टीन प्रोटीज की सक्रियता, जिसे कैसपेस के रूप में जाना जाता है, कोशिका मृत्यु के कई रूपों में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया बनी हुई है। कैसपेस एपोप्टोसिस के महत्वपूर्ण सर्जक और निष्पादनकर्ता हैं, जो क्रमादेशित कोशिका मृत्यु का सबसे अधिक अध्ययन किया गया रूप है। एपोप्टोसिस विकास प्रक्रियाओं के दौरान होता है और ऊतक होमियोस्टैसिस में एक आवश्यक घटना है। पाइरोप्टोसिस कोशिका मृत्यु का एक और रूप है जो कैसपेस का उपयोग करता है और सूजन के सक्रियण के माध्यम से प्रतिरक्षा प्रणाली को सक्रिय करने में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है, जिसके परिणामस्वरूप इंटरल्यूकिन -1 (आईएल -1) परिवार के सदस्यों की रिहाई होती है। कैसपेस गतिविधि का आकलन करने के लिए, लक्ष्य सब्सट्रेट्स का आकलन किया जा सकता है। हालांकि, एकल कोशिकाओं या निम्न-स्तरीय गतिविधि की जांच करते समय संवेदनशीलता एक मुद्दा हो सकता है। हम प्रदर्शित करते हैं कि फ्लो साइटोमेट्री द्वारा जनसंख्या-आधारित परख या एकल-सेल परख के साथ एक फ्लोरोजेनिक सब्सट्रेट का उपयोग कैसे किया जा सकता है। उचित नियंत्रण के साथ, विभिन्न अमीनो एसिड अनुक्रमों का उपयोग यह पहचानने के लिए किया जा सकता है कि कौन से कैसपेस सक्रिय हैं। इन परखों का उपयोग करके, ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर (टीएनएफ) उत्तेजना पर एपोप्टोसिस प्रोटीन के अवरोधकों के एक साथ नुकसान की पहचान की गई है, जो मुख्य रूप से कोशिका मृत्यु के अन्य रूपों के बजाय मैक्रोफेज में एपोप्टोसिस को प्रेरित करता है।
कैसपेस प्रोग्राम्ड सेल डेथ के कई रूपों में शामिल हैं। एपोप्टोसिस प्रोग्राम्ड सेल डेथ का सबसे अधिक अध्ययन किया गया रूप है और कैसपेज़ गतिविधि1 से जुड़ा हुआ है। सभी कैसपेस में एक बड़ा और छोटा उत्प्रेरक सबयूनिट होता है। कैसपेज़ -1, कैसपेज़ -4, कैसपेज़ -5, कैसपेज़ -9, और कैसपेज़ -11 में एक कैसपेज़ सक्रियण और भर्ती डोमेन (CARD) होता है, और कैसपेज़ -8 और कैस्पेज़ -10 में डेथ एफेक्टर डोमेन (DED)2,3,4,5 (तालिका 1) होते हैं। एपोप्टोसिस को दो प्रमुख मार्गों द्वारा शुरू किया जा सकता है: बाह्य मार्ग और आंतरिक मार्ग। बाह्य एपोप्टोटिक मार्ग मृत्यु रिसेप्टर्स द्वारा ट्रिगर किया जाता है, जो ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर सुपरफैमिली (टीएनएफएसएफ) का हिस्सा हैं। डेथ रिसेप्टर्स में डीईडी डोमेन होते हैं, जो कैसपेज़ -8 गतिविधि 6 की सुविधा प्रदान करतेहैं। आंतरिक एपोप्टोटिक मार्ग में एपोप्टोसोम के गठन के बाद कैसपेज़ -9 की सक्रियता शामिल है, जिसमें साइटोक्रोम सी और एपफ -1 7 की रिहाई की आवश्यकता होतीहै। या तो आरंभकर्ता कैस्पेज़, कैस्पेज़ -8 या कैसपेज़ -9 की सक्रियता, निष्पादनकर्ता कैसपेज़ के दरार और बाद में सक्रियण की ओर ले जाती है, जो कैसपेज़ -3, कैसपेज़ -6 और कैसपेज़ -7 हैं। यह पहचानना कि निष्पादक कैसपेस सक्रिय हैं, इंगित करता है कि कोशिकाएं एपोप्टोसिस से गुजर रही हैं, और इस सक्रियण को कोशिका मृत्यु के मोड को परिभाषित करने में एक महत्वपूर्ण कारक माना जाता है।
कैस्पेज़ सक्रियण सूजन को विनियमित करने और क्रमादेशित कोशिका मृत्यु के वैकल्पिक रूपों के प्रेरण के लिए एक महत्वपूर्ण मोड़ भी है। उदाहरण के लिए, कैसपेज़ -1 सक्रियण इंटरल्यूकिन -1 परिवार 8 के प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स की परिपक्वता की ओर जाताहै। इस परिवार से साइटोकिन्स की रिहाई और सक्रियण, विशेष रूप से आईएल -1 और आईएल -18, प्लाज्मा झिल्ली 9,10 पर गैसडर्मिन डी दरार और छिद्र गठन के परिणामस्वरूप होता है। गैसडर्मिन डी छिद्रों की अपर्याप्त झिल्ली की मरम्मत के परिणामस्वरूप एक प्रकार की कोशिका मृत्यु हो सकती है जिसेपाइरोप्टोसिस 11 के रूप में जाना जाता है। इसके अलावा, कैसपेज़ -8 गतिविधि के परिणामस्वरूप एक कैसपेज़-स्वतंत्र कोशिका मृत्यु का निषेध होता है जिसे नेक्रोप्टोसिस12 के रूप में जाना जाता है। रिसेप्टर-इंटरैक्टिंग सेरीन /थ्रेओनिन प्रोटीन काइनेज 1 (RIPK1) नेक्रोप्टोसिस में महत्वपूर्ण कारकों में से एक है और NF-kB द्वारा विनियमित सूजन को चलाने में है। मॉडल से पता चला है कि RIPK1 को कैसपेज़ -8 द्वारा छोड़ दिया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप NF-kB सिग्नलिंग, एपोप्टोसिस और नेक्रोप्टोसिस13,14 सीमित होते हैं। इसलिए, विभिन्न कैसपेस की गतिविधि की पहचान करने से परिणामस्वरूप सूजन और कोशिका मृत्यु पद्धति को समझने में सहायता मिल सकती है।
कोशिका मृत्यु के तौर-तरीकों को विनियमित करने में कैसपेस के कार्य से स्वतंत्र, कैसपेज़ गतिविधि संक्रमण15,16 के जवाब में इंटरफेरॉन (आईएफएन) जैसे अन्य साइटोकिन परिवारों को भी विनियमित कर सकती है। इसके अतिरिक्त, कैसपेस गैर-कोशिका मृत्यु कार्यों में शामिल हैं, जिसमें सेल भाग्य निर्णय, ऊतक की मरम्मत और पुनर्जनन, डीएनए मरम्मत के माध्यम से ट्यूमरजेनिसिस और न्यूरोनल सिनैप्स फ़ंक्शन शामिल हैं। इन गैर-घातक भूमिकाओं में कैसपेस की गतिविधि को सेलुलर स्थानीयकरण और कैसपेस की मात्रा से सीमित माना जाता है। इसलिए, कैसपेज़ गतिविधि के स्तर को निर्धारित करना अच्छी तरह से परिभाषित कर सकता है कि क्या एक कोशिका कोशिका मृत्यु से गुजरती है या क्या कैसपेज़ गैर-कोशिका मृत्यु समारोह 4,17,18 में भूमिका निभाता है।
कैसपेस गतिविधि का मूल्यांकन कई तरीकों से किया जा सकता है। क्लीवर कैसपेस और उनके सब्सट्रेट्स के लिए पश्चिमी सोख्ता का उपयोग गतिविधि के संकेतक के रूप में किया गया है, लेकिन ये परख सबसे अच्छा गुणात्मक हैं। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या कैसपेस गतिविधि कोशिका मृत्यु से जुड़ी है, एक मात्रात्मक माप आदर्श है। चूंकि कैस्पेस चार अमीनो एसिड, कलरमेट्रिक, ल्यूमिनेसेंस या फ्लोरोमेट्रिक विधियों से युक्त एक मान्यता स्थल पर सब्सट्रेट्स को छोड़ देते हैं। हालांकि, कैसपेस में उनके सब्सट्रेट मान्यता19,20 में प्लास्टिसिटी दिखाई देती है। मान्यता अनुक्रम प्रोटीन डोमेन (तालिका 1) से जुड़ा नहीं है। टेट्रापेप्टाइड अनुक्रम डीईवीडी, हालांकि, कैसपेज़ -3 और कैसपेज़ -7 गतिविधि20,21 का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
स्मैक मिमेटिक्स एपोप्टोसिस प्रोटीन (आईएपी) के अवरोधकों को लक्षित करने वाले यौगिक हैं। कैंसर कोशिकाओं के उप-समूह में स्मैक मिमेटिक्स का उपयोग कोशिकाओं को टीएनएफ-प्रेरित कोशिका मृत्यु के प्रति संवेदनशील होने का कारण बनताहै। प्राथमिक मैक्रोफेज में, स्मैक मिमेटिक्स टीएनएफ23,24 के बहिर्जात जोड़ के बिना कोशिका मृत्यु का कारण बनता है। स्मैक मिमेटिक-प्रेरित गिरावट द्वारा सीआईएपी 1 के नुकसान के परिणामस्वरूप टीएनएफ का उत्पादन होता है। यदि कैसपेस गतिविधि का पता लगाया जाता है, तो इसका मतलब है कि कोशिकाएं नेक्रोप्टोसिस से नहीं बल्कि एपोप्टोटिक तरीके से मर गईं। इस विधि में, कैसपेज़ -3 / कैसपेज़ -7 गतिविधि की पहचान करने के लिए क्लीवर डीईवीडी सब्सट्रेट का पता लगाने का उपयोग किया जाता है। एपोप्टोटिक कोशिका मृत्यु की पुष्टि करने के लिए आगे के प्रयोगपहले 24 प्रकाशित किए गए हैं।
इस विधि में, कैसपेज़ -3 / कैसपेज़ -7 गतिविधि को मापने के लिए जनसंख्या-आधारित परख या एकल-सेल विश्लेषण में एक फ्लोरोजेनिक सब्सट्रेट का उपयोग किया जाता है। दोनों विधियां एक सब्सट्रेट के दरार के आधार पर मात्रात्मक तरीके से कैसपेज़ गतिविधि को मापती हैं। एक लाभ कई नमूनों के लिए इन तरीकों का उपयोग करने की क्षमता है। इन विधियों के साथ, कैस्पेज़ -3 / कैसपेज़ -7 गतिविधि का पता प्राथमिक मैक्रोफेज में लगाया जाता है जो स्मैक मिमेटिक्स के साथ इलाज किया जाता है।
जनसंख्या-आधारित फ्लोरोमेट्रिक परख का एक महत्वपूर्ण पहलू लाइसिस से प्रतिदीप्ति को पढ़ने का समय है। नमूने को पूरी प्रक्रिया में बर्फ पर रखा जाना चाहिए, खासकर परख को “पढ़ने” से पहले। यह सब्सट्रेट के समय से पहले दरार और प्रतिदीप्ति को रोकता है। जनसंख्या-आधारित परख का उपयोग करके, कम अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। परख में उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन की मात्रा सामान्यीकृत है, जिससे नमूनों की सीधे तुलना की जा सकती है। एक चेतावनी यह है कि एपोप्टोटिक कोशिका मृत्यु के अंतिम चरण में, कुल प्रोटीन की मात्रा कम हो जाती है; इसलिए, कैसपेज़ गतिविधि का पता लगाना संभव नहीं हो सकता है। इस समस्या को दरकिनार करने के लिए विभिन्न कैनेटीक्स या विभिन्न उपचार खुराक की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, इस विधि में वर्णित सॉफ़्टवेयर के अलावा कैस्पेस गतिविधि की दर का सही आकलन करने के लिए अन्य सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है।
प्रवाह साइटोमेट्रिक परख के लिए, आबादी को आत्मविश्वास से गेट करने के लिए पर्याप्त घटनाओं या कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, सब्सट्रेट से सेल नंबर के इष्टतम अनुपात को प्राप्त करने के लिए प्रवाह-आधारित परख में अधिक अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। हालांकि, फ्लो साइटोमेट्री के साथ, यह विधि अतिरिक्त मापदंडों को मापने के लिए खुद को उधार देती है, जैसे कि सेल प्रकार की पहचान के लिए सेल सतह मार्कर।
जनसंख्या और एकल-कोशिका विधियों दोनों का उपयोग अन्य कैसपेस के लिए किया जा सकता है। हालांकि, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि मान्यता अनुक्रम अन्य कैसपेस के लिए कम भेदभाव किया जाता है। जैसे, कैस्पेस गतिविधि के लिए अन्य तरीकों का उपयोग किया जाना चाहिए। इसमें कैस्पेस गतिविधि का निषेध, सीआरआईएसपीआर या विशिष्ट कैसपेस का नॉक-डाउन, और ज्ञात सब्सट्रेट्स की दरार का पता लगाने के लिए पश्चिमी सोख्ता शामिल हैं।
कैसपेज़ गतिविधि का पता लगाने के लिए एक वैकल्पिक विधि टाइम-लैप्स इमेजिंग है। सेल मृत्यु के कैनेटीक्स पर जानकारी प्रदान करने के लिए एनेक्सिन वी जैसे व्यवहार्यता के अन्य मार्करों के साथ एक ही पारगम्य कैसपेस सब्सट्रेट का उपयोग किया जा सकता है। इमेजिंग कैस्पेस गतिविधि और सेल अस्तित्व को भी अलग करेगी, जिससे सेल आबादी में कैसपेस गतिविधि की उप-घातक मात्रा का पता लगाने की अनुमति मिलेगी। कैसपेज़ -3 / कैसपेज़ -7 के गैर-घातक कार्य जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं29 में एंटीवायरल विनियमन से जुड़े हुए हैं, विशेष रूप से माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए रिलीज15,16 के माध्यम से टाइप आई आईएफएन की सक्रियता। इस प्रकार, कैस्पेज़ गतिविधि को मापने के लिए ये परख कोशिका मृत्यु के विभिन्न तरीकों की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण हैं और गैर-कोशिका मृत्यु कार्यों का आकलन करने में उपयोगी हो सकते हैं।
The authors have nothing to disclose.
W.W.W. को क्लोएटा मेडिकल रिसर्च फेलो अनुदान द्वारा समर्थित किया जाता है, एसआर को CanDoc UZH Forschungskredit द्वारा समर्थित किया जाता है, और J.T. को चीनी छात्रवृत्ति परिषद द्वारा समर्थित किया जाता है।
1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
15 cm Petri plates | Sarstedt | 82.1184.500 | |
37 degree incubator shaker | IKA shaker KS 4000i | 97014-816 | distributed by VWR |
6-well cell culture dish | Sarstedt | 83.392 | |
96 well flat bottom, white polystyrene, non-sterile | Sigma | CLS3600 | |
96 well flat plate | Sarstedt | 82.1581 | |
Ac-DEVD-AFC | Enzo Life Sciences | ALX-260-032-M005 | Caspase-3 substrate |
BD Fortessa | BD | any flow cytometer with the appropriate excitation and emission detector will work | |
b-glycerolphosphate | Sigma | G9422-10G | |
caspase-3 recombinant | Enzo Life Sciences | ALX-201-059-U025 | |
CHAPS | Sigma | 1.11662 | |
DMEM, low glucose, pyruvate | Thermoscientific | 31885023 | |
DMSO | Sigma | D8418-250ML | |
EDTA | Sigma | 03685-1KG | |
EGTA | Sigma | 324626-25GM | |
Etoposide | MedChem Express | HY-13629 | |
FBS | Thermoscientific | 26140 | |
Flow cytometry tubes | Falcon | 352008 | |
Flowjo | Flowjo | A license in required but any program that can analyze .fcs files will suffice | |
Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Magic Red caspase-3/7 assay kit; flow cytometry or imaging | Immunochemistry Technologies | 935 | |
M-CSF | ebioscience | 14-8983-80 | now a subsidiary of Thermoscientific |
M-Plex | Tecan | any fluorometric reader will work with the appropriate excitation and emission detectors | |
NaCl | Roth | 3957.1 | |
PBS pH 7.4 | Thermoscientific | 10010023 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Thermoscientific | 10378016 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | protein concentration assay |
protease inhibitors | Biomol | P9070.100 | |
Smac mimetic, Compound A | Tetralogics | also known as 12911; structure shown in supplementary figures of Vince et al., Cell 2007 | |
Sodium Fluoride | Sigma | S7920-100G | |
sodium orthovanadate | Sigma | S6508-10G | |
sodium pyrophosphate | Sigma | P8010-500G | |
Staurosporine | MedChem Express | HY-15141 | |
sucrose | Sigma | 1.07687 | |
Tris Base | Sigma | T1503-1KG | |
Triton X100 | Sigma | T8787-50ML | |
TrypLE | Thermoscientific | A1285901 | In the protocol, it is listed as Trypsin |