Detta protokoll beskriver två metoder för att mäta kaspasaktivitet genom ett fluorogent substrat med hjälp av flödescytometri eller en spektrofluorometer.
Aktiveringen av cysteinproteaser, kända som kaspaser, är fortfarande en viktig process i flera former av celldöd. Caspases är kritiska initiatorer och bödlar av apoptos, den mest studerade formen av programmerad celldöd. Apoptos uppträder under utvecklingsprocesser och är en nödvändig händelse i vävnadshomeostas. Pyroptos är en annan form av celldöd som använder kaspaser och är en kritisk process för att aktivera immunsystemet genom aktivering av inflammasomen, vilket resulterar i frisättning av medlemmar av interleukin-1 (IL-1) familjen. För att bedöma kaspasaktivitet kan målsubstrat bedömas. Känslighet kan dock vara ett problem när man undersöker enskilda celler eller låg nivåaktivitet. Vi demonstrerar hur ett fluorogent substrat kan användas med en populationsbaserad analys eller encellsanalys genom flödescytometri. Med rätt kontroller kan olika aminosyrasekvenser användas för att identifiera vilka kaspaser som är aktiva. Med hjälp av dessa analyser har samtidig förlust av hämmare av apoptosproteiner vid stimulering av tumörnekrosfaktor (TNF) identifierats, vilket främst inducerar apoptos i makrofager snarare än andra former av celldöd.
Caspaser är involverade i flera former av programmerad celldöd. Apoptos är den mest studerade formen av programmerad celldöd och är associerad med kaspasaktivitet1. Alla kaspaser har en stor och liten katalytisk underenhet. Caspase-1, caspase-4, caspase-5, caspase-9 och caspase-11 har en kaspasaktiverings- och rekryteringsdomän (CARD), och caspase-8 och caspase-10 innehåller dödseffektordomäner (DED)2,3,4,5 (tabell 1). Apoptos kan initieras av två huvudvägar: den yttre vägen och den inre vägen. Den yttre apoptotiska vägen utlöses av dödsreceptorer, som ingår i tumörnekrosfaktorsuperfamiljen (TNFSF). Dödsreceptorer har DED-domäner, vilket underlättar kaspas-8-aktivitet6. Den inneboende apoptotiska vägen innefattar aktivering av kaspas-9 efter bildandet av apoptosomen, vilket kräver frisättning av cytokrom c och Apaf-17. Aktiveringen av antingen initiator caspase, caspase-8 eller caspase-9, leder till klyvning och efterföljande aktivering av bödelkaspaser, vilka är caspase-3, caspase-6 och caspase-7. Att identifiera att bödelns kaspaser är aktiva indikerar att cellerna genomgår apoptos, och denna aktivering anses vara en viktig faktor för att definiera celldödssättet.
Kaspasaktivering är också en kritisk tidpunkt för reglering av inflammation och induktion av alternativa former av programmerad celldöd. Exempelvis leder kaspas-1-aktivering till mognad av proinflammatoriska cytokiner i interleukin-1-familjen8. Frisättning och aktivering av cytokiner från denna familj, särskilt IL-1β och IL-18, beror på gasdermin D-klyvning och porbildning vid plasmamembranet 9,10. Otillräcklig membranreparation av gasdermin D-porer kan resultera i en typ av celldöd som kallas pyroptos11. Dessutom resulterar kaspas-8-aktivitet i hämning av en kaspasoberoende celldöd som kallas nekropotos12. Receptorinteragerande serin/treoninproteinkinas 1 (RIPK1) är en av de kritiska faktorerna i nekropotos och för att driva inflammation reglerad av NF-kB. Modeller har visat att RIPK1 klyvs av kaspas-8, vilket resulterar i att begränsa NF-kB signalering, apoptos och nekropotos13,14. Därför kan identifiering av aktiviteten hos olika kaspaser hjälpa till att förstå den resulterande inflammations- och celldödsmodaliteten.
Oberoende av kaspasernas funktion vid reglering av celldödsmodaliteter kan kaspasaktivitet också reglera andra cytokinfamiljer, såsom interferon (IFN), som svar på infektion15,16. Dessutom är kaspaser involverade i icke-celldödsfunktioner, inklusive cellödesbeslut, vävnadsreparation och regenerering, tumörgenes genom DNA-reparation och neuronal synapsfunktion. Aktiviteten hos kaspaser i dessa icke-dödliga roller tros begränsas av cellulär lokalisering och mängden kaspaser. Därför kan kvantifiering av nivån av kaspasaktivitet mycket väl definiera om en cell genomgår celldöd eller om kaspasen spelar en roll i en icke-celldödsfunktion 4,17,18.
Caspase aktivitet kan bedömas med flera metoder. Western blotting för klyvda kaspaser och deras substrat har använts som en indikator på aktivitet, men dessa analyser är i bästa fall kvalitativa. För att avgöra om kaspasaktivitet är associerad med celldöd är en kvantitativ mätning idealisk. Eftersom kaspaser klyver substrat på ett igenkänningsställe bestående av fyra aminosyror har kolorimetriska, luminiscens- eller fluorometriska metoder utvecklats. Kaspaser verkar dock ha plasticitet i sin substratigenkänning19,20. Igenkänningssekvensen är inte associerad med proteindomänerna (tabell 1). Tetrapeptidsekvensen DEVD kan emellertid användas för att detektera kaspas-3 och kaspas-7-aktivitet20,21.
Smac mimetika är föreningar som riktar sig mot hämmare av apoptosproteiner (IAP). Användningen av Smac-mimetika i en delmängd av cancerceller gör att cellerna blir känsliga för TNF-inducerad celldöd22. I primära makrofager orsakar Smac-mimetik celldöd utan exogen tillsats av TNF23,24. Förlusten av cIAP1 genom Smac mimetisk-inducerad nedbrytning resulterar i produktion av TNF. Om kaspasaktivitet detekteras betyder det att cellerna inte dog av nekrotos utan på ett apoptotiskt sätt. I denna metod används detektion av klyvt DEVD substrat för att identifiera kaspas-3 / kaspas-7 aktivitet. Ytterligare experiment för att bekräfta apoptotisk celldöd har publicerats tidigare24.
I denna metod används ett fluorogent substrat i en populationsbaserad analys eller encellsanalys för att mäta kaspas-3 / kaspas-7-aktivitet. Båda metoderna mäter kaspasaktiviteten på ett kvantitativt sätt baserat på klyvning av ett substrat. En fördel är möjligheten att utnyttja dessa metoder för många prover. Med dessa metoder detekteras kaspas-3/kaspas-7-aktivitet i primära makrofager behandlade med Smac-mimetika.
En kritisk aspekt av den populationsbaserade fluorometriska analysen är tiden från lys till avläsning av fluorescensen. Proverna skall ligga på is under hela förfarandet, särskilt innan testet “avläsas”. Detta förhindrar för tidig klyvning och fluorescens av substratet. Med hjälp av den populationsbaserade analysen kan mindre optimering krävas. Mängden protein som används i analysen normaliseras, vilket gör att proverna kan jämföras direkt. En varning är att i ett sent skede av apoptotisk celldöd reduceras den totala proteinmängden; Därför kan detektering av kaspasaktivitet inte vara möjlig. Olika kinetik eller olika behandlingsdoser rekommenderas för att kringgå detta problem. Dessutom kan annan programvara användas för att exakt bedöma graden av kaspasaktivitet förutom den programvara som beskrivs i denna metod.
För flödescytometrisk analys krävs tillräckligt med händelser eller celler för att grinda populationerna säkert. Dessutom kan mer optimering i den flödesbaserade analysen krävas för att uppnå det optimala förhållandet mellan substrat och cellantal. Men med flödescytometri lämpar sig denna metod för att mäta ytterligare parametrar, såsom cellytmarkörer för celltypidentifiering.
Både populations- och encellsmetoden skulle kunna användas för andra kaspaser. Det är dock viktigt att komma ihåg att igenkänningssekvensen är mindre diskriminerad för andra caspaser. Som sådan måste andra metoder för kaspasaktivitet användas. Detta inkluderar hämning av kaspasaktivitet, CRISPR eller knock-down av specifika kaspaser och västerländsk blotting för att detektera klyvning av kända substrat.
En alternativ metod för att detektera kaspasaktivitet är time-lapse imaging. Samma permeabla kaspassubstrat kan användas tillsammans med andra markörer för livskraft, såsom annexin V, för att ge information om kinetiken för celldöd. Avbildning skulle också separera kaspasaktiviteten och cellöverlevnaden, vilket möjliggör detektion av subletala mängder kaspasaktivitet i en cellpopulation. De icke-dödliga funktionerna hos kaspas-3/kaspas-7 är kopplade till antiviral reglering i medfödda immunceller29, särskilt aktivering av typ I IFN via mitokondriell DNA-frisättning15,16. Således är dessa analyser för att mäta kaspasaktivitet avgörande för att identifiera olika former av celldöd och kan vara användbara vid bedömning av icke-celldödsfunktioner.
The authors have nothing to disclose.
W.W.W. stöds av Clöetta Medical Research Fellow-bidrag, SR stöds av CanDoc UZH Forschungskredit och JT stöds av det kinesiska stipendierådet.
1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
15 cm Petri plates | Sarstedt | 82.1184.500 | |
37 degree incubator shaker | IKA shaker KS 4000i | 97014-816 | distributed by VWR |
6-well cell culture dish | Sarstedt | 83.392 | |
96 well flat bottom, white polystyrene, non-sterile | Sigma | CLS3600 | |
96 well flat plate | Sarstedt | 82.1581 | |
Ac-DEVD-AFC | Enzo Life Sciences | ALX-260-032-M005 | Caspase-3 substrate |
BD Fortessa | BD | any flow cytometer with the appropriate excitation and emission detector will work | |
b-glycerolphosphate | Sigma | G9422-10G | |
caspase-3 recombinant | Enzo Life Sciences | ALX-201-059-U025 | |
CHAPS | Sigma | 1.11662 | |
DMEM, low glucose, pyruvate | Thermoscientific | 31885023 | |
DMSO | Sigma | D8418-250ML | |
EDTA | Sigma | 03685-1KG | |
EGTA | Sigma | 324626-25GM | |
Etoposide | MedChem Express | HY-13629 | |
FBS | Thermoscientific | 26140 | |
Flow cytometry tubes | Falcon | 352008 | |
Flowjo | Flowjo | A license in required but any program that can analyze .fcs files will suffice | |
Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Magic Red caspase-3/7 assay kit; flow cytometry or imaging | Immunochemistry Technologies | 935 | |
M-CSF | ebioscience | 14-8983-80 | now a subsidiary of Thermoscientific |
M-Plex | Tecan | any fluorometric reader will work with the appropriate excitation and emission detectors | |
NaCl | Roth | 3957.1 | |
PBS pH 7.4 | Thermoscientific | 10010023 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Thermoscientific | 10378016 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | protein concentration assay |
protease inhibitors | Biomol | P9070.100 | |
Smac mimetic, Compound A | Tetralogics | also known as 12911; structure shown in supplementary figures of Vince et al., Cell 2007 | |
Sodium Fluoride | Sigma | S7920-100G | |
sodium orthovanadate | Sigma | S6508-10G | |
sodium pyrophosphate | Sigma | P8010-500G | |
Staurosporine | MedChem Express | HY-15141 | |
sucrose | Sigma | 1.07687 | |
Tris Base | Sigma | T1503-1KG | |
Triton X100 | Sigma | T8787-50ML | |
TrypLE | Thermoscientific | A1285901 | In the protocol, it is listed as Trypsin |