Questo protocollo delinea un esperimento di migrazione in vitro adatto all'analisi funzionale delle molecole coinvolte nella migrazione in vivo delle cellule della cresta neurale nella matrice extracellulare ricca di ialuronano.
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Articolo metodologico
In vitro Studio degli effetti della matrice extracellulare ricca di ialuronana sulla migrazione delle cellule della cresta neurale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule della cresta neurale (NCC) sono cellule altamente migratorie che provengono dalla regione dorsale del tubo neurale. L'emigrazione di NCC dal tubo neurale è un processo essenziale per la produzione di NCC e la loro successiva migrazione verso siti bersaglio. La via migratoria delle NCC, compresi i tessuti del tubo neurale circostante, coinvolge la matrice extracellulare ricca di acido ialuronico (HA). Per modellare la migrazione NCC in questi tessuti circostanti ricchi di HA dal tubo neurale, in questo studio è stato stabilito un saggio di migrazione del substrato misto costituito da HA (peso molecolare medio: 1.200-1.400 kDa) e collagene di tipo I (Col1). Questo test di migrazione dimostra che le cellule della linea cellulare NCC, O9-1, sono altamente migratorie sul substrato misto e che il rivestimento HA è degradato nel sito di aderenze focali nel corso della migrazione. Questo modello in vitro può essere utile per un'ulteriore esplorazione delle basi meccanicistiche coinvolte nella migrazione NCC. Questo protocollo è applicabile anche per valutare diversi substrati come scaffold per studiare la migrazione NCC.
Introduzione
Le cellule della cresta neurale (NCC) sono una popolazione cellulare multipotente presente negli embrioni in via di sviluppo e provengono dal bordo della piastra neurale durante la neurulazione. Contribuiscono alla formazione di una varietà di tessuti, tra cui il sistema nervoso periferico, il sistema cardiovascolare, i tessuti craniofacciali e lo scheletro1. Dopo l'induzione e la specifica NCC al bordo della piastra neurale, gli NCC emigrano dal neuroepitelio e migrano verso i siti tissutali derivati da NCC1.
L'acido ialuronico (HA) è un glicosaminoglicano non solfato distribuito in una varie....
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Protocollo
Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato etico animale della Scuola di specializzazione in odontoiatria dell'Università di Osaka.
1. Coltura di cellule della cresta neurale cranica di topo
NOTA: La linea cellulare della cresta neurale utilizzata in questo studio comprende cellule O9-1, originariamente derivate da Wnt1-Cre; Cellule che esprimono R26R-GFP isolate da embrioni di topo E8.512 (vedi discussione). Il metodo qui descritto per la coltura di cellule O9-1 segue un protocollo13 precedentemente stabilito.
- ....
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Risultati
Un saggio di migrazione è stato eseguito su substrati misti composti da Col1 e HA ad alto peso molecolare (peso molecolare medio: 1.200-1.400 kDa) utilizzando il protocollo qui descritto. Si è scoperto che le cellule O9-1 al confine del gap migrano facilmente nel gap ricco di HA (Figura 4). L'immunocolorazione per un marcatore FA, la vinculina14, ha confermato che le cellule O9-1 formavano aderenze focali (FA) nei siti di degradazione dell'HA (Fig.......
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Discussione
Diverse componenti dell'ECM regolano l'emigrazione/migrazione dei NCC. Ad esempio, l'HA regola positivamente la migrazione NCC 2,15. È interessante notare che uno studio basato su modelli genetici murini di Tmem2, una ialuronidasi della superficie cellulare, ha chiarito il requisito della degradazione dell'HA nella migrazione NCC9. I collageni sono anche abbondanti nella ECM che circonda il tubo neurale16. Decorin, .......
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Dichiarazioni
L'autore dichiara che non esistono interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Esprimo grande gratitudine a Fumitoshi Irie e Yu Yamaguchi per il loro incoraggiamento e i gentili suggerimenti nello stabilire questo metodo. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni in aiuto per programmi di ricerca scientifica dalla Japan Society for the Promotion of Science (#19KK0232 a T.I., #20H03896 a T.I.). Il metodo originale per il rivestimento di HA su substrati di vetro e saggi di degradazione dell'HA in situ sui substrati è stato descritto in Yamamoto et al. (2017) 8, mentre il metodo per la preparazione di substrati misti HA / Col1 è stato descritto in Irie et al. (2021) 7.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piatto per coltura cellulare 10cm | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. No. BSS-1005-B | |
| Inserti colturali a 2 pozzetti | ibidi | Cat. No. 80209 | |
| Alexa 555 marcato capra anti-topo IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | cellule anticorpali secondari anti-topo derivati da capra |
| Bio-Rad | Cat. No. TC20 | ||
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Mezzo di congelamento cellulare |
| collagene tipo I | Sigma | Cat. N. 08-115 | |
| Cella ES completa media | millipore | cat. No. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco' s Aquila modificata media | Gibco | Cat. 11971025 | |
| Siero fetale bovino | Gibco | Cat. 10270106 | |
| microscopio a fluorescenza | Keyence | Cat. No. BZ-X700 | |
| Fluoresent marcato HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Piatto inferiore in vetro | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| glutaldeide | Sigma | Cat. N° G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. No. CB-40234 | L'anticorpo |
| monoclonale anti-vinculina | Sigma | Cat. No. V9264 | |
| terreno di montaggio | Dako | S3023 | |
| Siero di capra normale | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 cellule | Millipore | Cat. No. SCC049 | |
| Paraformaldeide | Sigma | Cat. 158127 | |
| trietossisilano | Sigma | Cat. N. 390143 | |
| tripsina-EDTA | Millipore | Cat. No. SM-2003-C |
Riferimenti
- Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326(2013).
- Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is req....
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Ristampe e permessi
