In vitro Undersøgelse af virkningerne af den hyaluronanrige ekstracellulære matrix på neurale kamcellemigration
Summary
Denne protokol skitserer et in vitro-migrationseksperiment, der er egnet til funktionel analyse af molekylerne involveret i in vivo-migration af neurale kamceller til den hyaluronanrige ekstracellulære matrix.
Abstract
Neurale kamceller (NCC’er) er stærkt vandrende celler, der stammer fra rygområdet i neuralrøret. Udvandringen af NCC’er fra neuralrøret er en vigtig proces for NCC-produktionen og deres efterfølgende migrering mod målsteder. NCC’ernes migrationsrute, herunder det omgivende neuralrørsvæv, involverer hyaluronan (HA)-rig ekstracellulær matrix. For at modellere NCC-migration til disse HA-rige omgivende væv fra neuralrøret blev der i dette studie etableret et blandet substratmigrationsassay bestående af HA (gennemsnitlig molekylvægt: 1.200-1.400 kDa) og kollagen type I (Col1). Dette migrationsassay viser, at NCC-cellelinje, O9-1, celler er stærkt vandrende på det blandede substrat, og at HA-belægningen nedbrydes på stedet for fokale adhæsioner i løbet af migrationen. Denne in vitro-model kan være nyttig til yderligere udforskning af det mekanistiske grundlag, der er involveret i NCC-migration. Denne protokol er også anvendelig til evaluering af forskellige substrater som stilladser for at studere NCC-migration.
Introduction
Neurale kamceller (NCC’er) er en multipotent cellepopulation, der er til stede i udviklende embryoner, og de stammer fra den neurale pladegrænse under neurulering. De bidrager til dannelsen af en række væv, herunder det perifere nervesystem, kardiovaskulære system, kraniofaciale væv og skelet1. Efter induktion og NCC-specifikation ved neurale pladegrænsen emigrerer NCC’er fra neuroepitelet og migrerer mod NCC-afledte vævssteder1.
Hyaluronan (HA) er en ikke-sulfateret glycosaminoglycan, der fordeles i en række væv som en komponent i den ekstracellulære matrix (ECM). Betydningen af HA i embryoudvikling er blevet demonstreret i modelsystemer gennem ablation af gener, der er ansvarlige for hyaluronan metabolisme. For eksempel viste mutationer i hyaluronansyntase gener (Has1 og Has2) i Xenopus sig at føre til NCC-migrationsdefekter og kraniofacial misdannelse2. Derudover er det rapporteret, at de HA-bindende proteoglycaner, aggrecan og versican, udøver hæmmende virkninger på NCC-migration3. Hos mus fører Has2-ablation til alvorlige defekter i dannelsen af endokardiepuder, hvilket resulterer i dødelighed 4,5,6 midt i drægtigheden (E9.5-10).
Transmembranprotein 2 (Tmem2), en celleoverfladehyaluronidase, har for nylig vist sig at spille en kritisk rolle i at fremme integrinmedieret kræftcelleadhæsion og migration ved at fjerne matrixassocieret HA på vedhæftningsstederne 7,8. For nylig viste Inubushi et al.9, at en mangel på Tmem2 fører til alvorlige kraniofaciale defekter på grund af abnormiteter i NCC emigration / migration og overlevelse. I den tidligere undersøgelse9 blev Tmem2-ekspression analyseret under NCC-dannelse og migration. Tmem2-ekspression blev observeret på stedet for NCC-delaminering og i emigrerende Sox9-positive NCC’er (figur 1). Derudover viste undersøgelsen ved hjælp af Tmem2-depleterede O9-1 neurale kamceller i mus, at in vitro-ekspressionen af Tmem2 var afgørende for, at O9-1-cellerne kunne danne fokale adhæsioner og for deres migration til HA-holdige substrater (figur 2 og figur 3)9.
Disse resultater indikerer kraftigt, at Tmem2 også er vigtig for NCC’s vedhæftning og migration gennem den HA-rige ECM. Den molekylære mekanisme for NCC-adhæsion og migration inden for den HA-rige ECM er dog stadig uklar. Det er derfor nødvendigt at etablere et di vitro-dyrkningseksperimentelt system for fuldt ud at udforske NCC-adhæsion og migration inden for det HA-rige ECM.
Af de mange tilgange, der anvendes til test af cellemigration, er cellesårlukningsbaseret assay en simpel metode, der ofte anvendes inden for fysiologi og onkologi10. Denne tilgang er nyttig på grund af dens relevans for di vivo-fænotypen og er effektiv til at bestemme stoffers og kemoattractants roller under cellemigration11. Det er muligt at evaluere migrationsevnen for både hele cellemasser og individuelle celler ved at måle cellegabafstandene over tid11. I dette manuskript introduceres et modificeret in vitro sårlukningsbaseret assay for at modellere NCC-migration til HA-rige væv omkring neuralrøret. Denne procedure er også anvendelig til undersøgelse af forskellige ECM-komponenter (dvs. kollagener, fibronectin og laminin) for at analysere ECM-stilladsets rolle i NCC-migration.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forskellige ECM-komponenter regulerer NCC’s udvandring/migration. For eksempel regulerer HA positivt NCC-migration 2,15. Interessant nok belyste et studie baseret på genetiske musemodeller af Tmem2, en celleoverfladehyaluronidase, behovet for HA-nedbrydning ved NCC-migration9. Kollagener er også rigelige i ECM omkring neuralrøret16. Decorin, en lille leucinrig proteoglycan, har vist sig at regulere NCC-migration …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jeg udtrykker stor anerkendelse til Fumitoshi Irie og Yu Yamaguchi for deres opmuntring og venlige forslag til etablering af denne metode. Dette arbejde blev støttet af tilskud til videnskabelige forskningsprogrammer fra Japan Society for the Promotion of Science (#19KK0232 til T.I., #20H03896 til T.I.). Den oprindelige metode til belægning af HA på glassubstrater og in situ HA-nedbrydningsassays på substraterne blev beskrevet i Yamamoto et al. (2017)8, mens metoden til fremstilling af HA/Col1 blandede substrater blev beskrevet i Irie et al. (2021)7.
Materials
| 10cm cell culture dish | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. No. BSS-1005-B | |
| 2-well culture inserts | ibidi | Cat. No. 80209 | |
| Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | Goat derived anti-mouse secondary antibody |
| automated cell counter | Bio-Rad | Cat. No. TC20 | |
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Cell freezing medium |
| collagen type I | Sigma | Cat. No. 08-115 | |
| Complete ES Cell Medium | Millipore | Cat. No. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | Cat. 11971025 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | Cat. 10270106 | |
| fluorescence microscope | Keyence | Cat. No. BZ-X700 | |
| Fluoresent labelled HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Glas bottom dish | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| glutaldehyde | Sigma | Cat. No. G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. No. CB-40234 | The basement-membrane matrix |
| monoclonal anti-vinculin antibody | Sigma | Cat. No. V9264 | |
| mounting media | Dako | S3023 | |
| Normal goat serum | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 cells | Millipore | Cat. No. SCC049 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | Cat. 158127 | |
| triethoxysilane | Sigma | Cat. No. 390143 | |
| trypsin-EDTA | Millipore | Cat. No. SM-2003-C |
Riferimenti
- Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326 (2013).
- Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development. Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).
- Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth. Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).
- Camenisch, T. D., et al. Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).
- Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors. Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Irie, F., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites. Journal of Biological Chemistry. 296, 100481 (2021).
- Yamamoto, H., et al. A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase. Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).
- Inubushi, T., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival. PLoS Genetics. 18 (7), 1009765 (2022).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
- Pijuan, J., et al. Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Humphries, J. D., et al. Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).
- Perris, R., Perissinotto, D. Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration. Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).
- Perris, R., et al. Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development. Development. 111 (2), 583-599 (1991).
- Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. Decorin developmental expression and function in the early avian embryo. The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).
- Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin. Biologia dello sviluppo. 136 (1), 222-238 (1989).
- Chevalier, N. R., et al. How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration. Scientific Reports. 6, 20927 (2016).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).
- Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells. Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).
- Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).
- Robert, G. A., et al. Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces. The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).
