Her presenterer vi en metode for å få bilder av tarmen ved laserindusert sår. Ved å utsette musetarmen for en multifotonlaser, induseres tapet av en enkelt eller flere krypter lokalt. Ved å gjentatte ganger avbilde det skadede området over måneder, fanges sanntidsdynamikken i tarmutvinning.
Å undersøke intestinal utvinning in vivo er en utsøkt teknisk utfordring. Mangel på langsgående avbildningsprotokoller har forhindret dypere innsikt i celle- og vevsskaladynamikken som orkestrerer tarmregenerering. Her beskriver vi en intravital mikroskopimetode som lokalt induserer vevsskade på enkeltkryptskalaen og følger den regenerative responsen til tarmepitelet hos levende mus. Enkeltkrypter eller større tarmfelt ble ablert av en høyintensiv multifoton infrarød laser på en tids- og romstyrt måte. Påfølgende langvarig repeterende intravital avbildning muliggjorde sporing av de skadede områdene over tid og tillot overvåking av kryptdynamikk under vevgjenoppretting over en periode på flere uker. Kryptremodelleringshendelser som kryptfisjon, fusjon og forsvinning ble observert i nabovevet ved laserindusert skade. Denne protokollen muliggjør studier av kryptdynamikk både i homeostatiske og patofysiologiske innstillinger, for eksempel aldring og tumorinitiering.
Epitelforingen i tarmen blir stadig utfordret av magesyrer, toksiner og mikrobiota som kan forårsake forstyrrelse av epitelbarrieren. Tarmstruktur og vevsorganisasjon er spesialisert på å stadig selvfornye og reparere skader. Det enkeltlags epitelet i tynntarmen er organisert i krypt-villus-enheter1. I homeostase gir selvfornyende Lgr5+ intestinale stamceller som ligger i bunnen av krypten opphav til differensiert avkom. De differensierte dattercellene reiser til spissen av villusaksen i en transportbåndmote, hvor de kastes slik at tarmforingen fylles på 3-5 dager 2,3. På lang sikt bidrar ikke alle Lgr5+-celler like mye til vevsfornyelse, da dette også avhenger av cellens evne til å bevege seg mot transportbåndet mot bunnen av krypten (dvs. retrograd bevegelse)4,5. Faktisk, ved ablasjon av Lgr5 + celler ved for eksempel stråling, beveger stamceller utenfor kryptens base inn i basen for å dedifferensiere og fylle stamcellebassenget 6,7,8.
Akutt betennelse kan føre til tap av Lgr5+ stamceller 9,10. I tillegg til tap av stamceller, kan mange eksterne faktorer forårsake akutt skade på epitelet i kryptskalaen. Stråling, kjemiske behandlinger og antibiotika har vist seg å skade tarmkrypter og villi11. Større felt av krypter og villi kan påvirkes av bakterielle, virale og parasittiske infeksjoner12. Tarmen har en bemerkelsesverdig evne til å komme seg etter indre og ytre skader i kryptskalaen ved kryptfisjon (en deling av en krypt i to)13. Ved sår gjennomgår krypter i området ved siden av skaden fisjon for å fylle opp kryptnumrene. Dette fenomenet forekommer også, men i mindre grad under homeostase14,15. For å motvirke en potensiell økning i kryptnumre under homeostase, kan krypter også smelte sammen (slå sammen to krypter til en)16,17. Hvorvidt kryptfusjon også spiller en rolle i å gjenopprette kryptnumre etter sår, er ukjent. Videre gjenstår dynamikken og reguleringsfaktorene i denne prosessen å bli belyst.
Skademodeller er uunnværlige for å studere vevregenerering in vivo. Ulike skademodeller har blitt brukt til å studere regenerering av tarmvev. Tidligere eksperimentelle strategier benyttet høydosestråling for å tømme stamcellebassenger18 eller behandling med dekstransulfatnatrium (DSS) for å indusere kronisk og akutt kolitt og krypttap hos mus19,20. Enkeltcelleablasjon ved genetiske eller optiske midler har blitt brukt til å avgrense vevskader og ansett som et attraktivt verktøy for å disentangle rollen som stam- og stamceller 21,22 og studere vaskulær regenerering23. I tillegg er det utviklet et biopsiskadesystem for å indusere skade i større felt i flere krypter og villi24. Det er viktig at responsen på den skadelige fornærmelsen kan variere langs tarmens proksimal-distale akse, som rapportert for stråling, noe som forårsaket mer skade i tynntarmen enn i tykktarmen25. Dette understreker behovet for målrettede metoder som kontrollerer både omfanget av den skadelige fornærmelsen og lokaliseringen i tarmkanalen.
Skadeomfang og gjenvinning har tradisjonelt blitt vurdert med statiske midler, som gir begrenset informasjon om dynamikken i vevsgjenvinning. Intravital mikroskopi (IVM) har åpnet unike muligheter til å kvantifisere stamcelleadferd, epitelial remodellering og regenerering i mange organer 26,27,28,29,30, og har gitt virkningsfull innsikt i tarmbiologi 4,5,21,31,32,33,34, 35,36.
Her beskriver vi en metode for å forårsake spatiotemporal definert tarmskade og fange opp gjenvinningen av tarmepitelforingen. Vi bruker to fotonbaserte laserablasjon for å skade tarmkrypter og følge den umiddelbare sårresponsen og langsiktig gjenoppretting ved repeterende intravital mikroskopi. Vår protokoll gjør det mulig å kartlegge den regenerative remodelleringen av tarmvevsarkitekturen som respons på lokale vevskader. Kryptdynamikk, inkludert fisjons- og fusjonshendelser, kan lett kvantifiseres og spores over tid. Anvendelsen av laserablasjon og repeterende intravital avbildning kan benyttes som en plattform for å undersøke vevsskaladynamikken i tarmarkitekturen under homeostase og patofysiologi, for eksempel tumorinitiering.
Denne protokollen kombinerer mikroskopisk laserablasjon og langsgående intravital mikroskopi for å følge intestinal regenerering fra tidlig skaderespons til langvarig vevsremodellering. Teknikken er etablert i streng overholdelse av etiske hensyn for å indusere og avbilde mikroskopisk laserablasjon, og når den følges nøyaktig, vil den opprettholde dyrs velvære. Under operasjonen er det viktig å sørge for at tarmens integritet er godt bevart. Dette kan oppnås ved forsiktig håndtering av vevet med sterile våte bomullspinner, som forhindrer blødning eller uttørking av vevet. Omfanget av laserindusert mikroskopisk skade bør også vurderes nøye ved avbildning av de forskjellige tarmlagene i området etter laserablasjon. Dersom forskeren ønsker å tilpasse hyppigheten av forsøkstrinnene beskrevet i denne protokollen, bør instituttets dyreetiske komité konsulteres før forsøket for å fastslå konsekvensen for velferden.
Repeterende intravital mikroskopi gjør det mulig å overvåke vevsgjenoppretting i samme mus over tid. Gjentatt kirurgisk eksponering av tarmen gir lett optisk tilgang til hele tarmkanalen. Vevets iboende egenskaper, som vaskulaturen, tjener som landemerker for å identifisere de samme tarmområdene i hver bildebehandling. Dermed kan det samme vevsområdet avbildes over flere uker, noe som gjør det mulig å kvantifisere langvarig vevregenerering i samme tarmområde i samme mus. Den spatiotemporale kontrollen som tilbys av den kombinerte kirurgiske og avbildningsmetoden, gir fordelen at det samme organet kan avbildes under både homeostatiske og regenererende forhold i samme mus, noe som står i motsetning til tidligere helorganskademodeller hvor kontroller og regenererende prøver stammer fra forskjellige mus 11,12,18,19,20 . Derfor minimerer vår eksperimentelle innstilling det nødvendige antall dyr som trengs for forsøket og reduserer intra-animalsk variasjon.
Feilsøking av protokoller bør starte med en gjennomgang av mus- og tarmhåndteringsteknikken, og en kontroll av mikroskopiutstyr og innstillinger. Det er mange kritiske trinn i denne protokollen som krever ekstra oppmerksomhet. For det første, for å sikre dyrevelferd og kontinuerlig høy datakvalitet, må alt arbeid utføres i et rent, sterilt miljø ved hjelp av aseptisk teknikk, og musetemperaturen bør opprettholdes under operasjonen og hver avbildningsøkt. Å holde vevet hydrert med sterilt, forvarmet saltvann under avbildning er viktig og forhindrer vevsfibrose.
For å sikre at eksperimentet utføres på en reproduserbar måte, er det viktig å justere laserne før bruk for optimal anskaffelse og å måle utgangseffekten til multifotonlaseren i begynnelsen av hver økt. Parametere som type mål, forstørrelse, boligtid, lasereffekt og bølgelengde har innflytelse på omfanget av mikroskopisk laserablasjon og bør vurderes. I denne studien utføres både laserablasjon og avbildning med en lasereffekt på 1,2 W (ut av linsen) ved en bølgelengde på 960 nm gjennom et Fluotar VISIR 25x/0,95 VANNMÅL. Endring av bølgelengde eller optisk skanningsegenskaper påvirker omfanget av mikroskopisk skade. En lavere bølgelengde (for eksempel 840 nm) oversetter til fotoner med høyere energi og ofte i en høyere utgang av laseren, og kan forbedre mikroskopisk skade. En høyere zoom resulterer i mer energi per region, og derfor mindre tid til å ablate krypter, og omvendt. Pikseloppholdstiden kan også økes eller reduseres for å endre ablasjonshastigheten og skadeomfanget. Når det avbildede vevet ikke er stabilt (f.eks. på grunn av peristaltiske bevegelser), må ablasjon utføres raskt. For dette formålet bør ablasjonshastigheten optimaliseres ved for eksempel å øke zoom- og/eller laserutgangen.
Å finne det samme tarmområdet over flere bildebehandlingsøkter er et annet kritisk skritt som må utføres riktig for å sikre at eksperimentet lykkes. For å gjøre det, må tarmen plasseres på nøyaktig samme måte til enhver tid. Vi anbefaler å alltid bruke cecum som referansepunkt for å finne de samme områdene i tynn- og tyktarmen. Forsiktig strekking av vevet av interesse med bomullspinner sikrer at interesseområdet er innenfor rekkevidden av den objektive arbeidsavstanden og maksimerer antall regioner som kan spores tilbake. I tillegg anbefaler vi at du alltid ablater og avbilder flere mikroskopiske posisjoner i hver mus for å ta hensyn til regioner som kanskje ikke er lokalisert tilbake i en senere bildebehandlingsøkt. Hvis regionene ikke kan bli funnet, selv om plasseringen av tarmen er riktig, kan det bidra til å flytte musen og endre orienteringen til det eksponerte området. Sporing av krypter over tid kan være tungvint for eksperimenter der større tarmfelt i flere tilstøtende krypter ablateres. Slike skadelige fornærmelser kan fremkalle vevsremodellering utover epitelmonolaget, noe som kan kulminere i modifikasjon av vevslandemerkene som brukes til sporing av regionen over tid. Å velge landemerker i tilstrekkelig avstand til det skadede stedet og fange større synsfelt som overgår det skadede området med flere hundre mikrometer, øker sjansen for vellykkede langsiktige eksperimenter. I tillegg til feil posisjonering av tarmen på mikroskopstadiet, kan peristaltiske bevegelser i mage-tarmkanalen forstyrre avbildning. Dette problemet kan bedres på to måter. Hvis bevegelsesfrekvensen ikke er for høy, kan prosessen gjentas i samme region med økt eksponeringstid. Alternativt kan høyere mengder anestesi brukes til å redusere peristaltikk. Vi anbefaler å begrense høyere doser isofluran til korte justeringer. Samlet sett bør bildeøktene holdes så korte som mulig, optimalt under 3 timer, for å sikre rask restitusjon.
Den kombinerte laserablasjon og langsgående intravital mikroskopi tilnærming har flere fordeler sammenlignet med andre skademodeller. Tidligere (kjemiske) skademodeller manglet evnen til lokalt å begrense den skadelige fornærmelsen 6,11,12,19,20. Laserablasjon overvinner denne mangelen ved å begrense skaden til et definert område av interesse. Dette gjør det mulig for forskerne å kontrollere skadestedet, samt skadeomfanget. Skadealvorlighetsgrad kan moduleres for å ablate krypter eller hele mikroskopiske tarmfelt for å informere om regenerative responser i kryptskalaen. I tillegg til romlig kontroll, tillater laserablasjon også å nøyaktig time utbruddet av skade, og overgår dermed presisjonen til tidligere legemiddel-, kjemiske og infeksjonsmodeller 9,10,11,12,19,20. Vår protokoll utvider tidligere studier som brukte laserindusert termisk ablasjon som en metode for å indusere lokalisert skade i tarmen21,23. Tidligere laserinduserte skademodeller avbildet lokale områder i tynntarm21 eller luminaloverflaten til distal colon23. Den kombinerte kirurgiske og laserablasjonsmetoden gjør det mulig å visualisere tarmepitelet (spesielt krypter) med høy oppløsning, og å utføre laserablasjon og oppfølgingsavbildning av vevsgjenoppretting i en hvilken som helst posisjon i tynntarmen, cecum og proksimal kolon. Den fanger utvinningen av de samme tarmområdene over tid, slik at man kan visualisere forskjellige lag i tarmen (slimhinner, submukosa, muscularis og serosa) i henhold til eksperimentelt oppsett. Vår teknikk er hovedsakelig skreddersydd for langvarig gjentatt avbildning i en periode på flere uker / måneder. For å studere den kortsiktige gjenopprettingsdynamikken til krypter (f.eks. i flere påfølgende dager etter skade), kan laserablasjonsmetoden beskrevet her kombineres med intravitale bildevinduer27,28,40.
Denne protokollen kan brukes til en rekke forskningsapplikasjoner fra ulike vitenskapelige områder som spenner over regenerering, immunologi og kreftforskning. Longitudinell avbildning av intestinal regenerering kaster lys over den cellulære dynamikken som bevarer epitelintegritet og barrierefunksjon, muliggjør vertsforsvar mot patogener i tarmlumenet, og som ligger til grunn for clearance og spredning av onkogene mutasjoner. Hvert vitenskapelig spørsmål vil stille unike krav til omfanget av laserindusert skade og varigheten av bildebehandling. Fluorescerende reportermus og injiserte fargestoffer kan drastisk utvide og forfine dataene som kan anskaffes ved å tillate visualisering av hvilken som helst celle og struktur av interesse. For eksempel kan en Lgr5-CreERt2: Rosa26-Confetti-mus brukes til å visualisere stamcelleprogenier, mens Rosa26-mTmG-reporteren informerer om vevsarkitektur. Sammen gjør disse nylige teknologiske fremskrittene intravital intestinal eksperimentering et lukrativt verktøy for å fremme vår forståelse av tarmbiologi og sykdom.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av Netherlands Organization of Scientific Research NWO (Vici grant 09150182110004 til JVR og Veni grant 09150161910151 til H.A.M.), OCENW. GROOT.2019.085 (til J.v.R), og et EMBO postdoktorstipend (stipend ALTF 452-2019 til H.A.M).
Anesthesia induction box | Veterinary Technics | ||
Autoclave | Certoclav | ||
Betadine | Mylan | 202809 | |
Diaper (underpad) | Absorin comfort | ||
Dumont forceps | Fine Scientific Tools | 11255-20 or 11272-40 | Inox, style #55, used to hold the peritoneum |
Enzymatic instrument cleaner | Roboz | EC-1000 | |
Ethanol 80% | homemade | NA | |
Eye ointment | Duratears Z (Alcon) | 288/28282-6 | |
Fine Scissors Straight 9 cm | Fine Scientific Tools | 14060-09 | Used to cut skin and peritoneum of the mouse |
Gauze 5 cmX5 cm | Cutisoft (Bsn medical) | 45847-00 | |
Graefe Forceps Curved Serrated | Fine Scientific Tools | 11051-10 | Used to hold the skin |
Hartman Hemostat Straight | Fine Scientific Tools | 13002-10 | Used for suturing |
Heating pad | Comfort | T5-5000 | |
Imaging box | Custom made | ||
Incision film | Nobafilm | 172215 | |
Inverted multi-photon microscope with automated stage | Leica Microsystems | NA | |
Isoflurane (vetflurane) | Pharmachemie BV, Haarlem, Netherlands | 305788 | |
Isoflurane vaporizer | Penlon sigma delta | ||
Micropore paper tape | Micropore | ||
NaCl 0.9% | Braun | Other brands available | |
Needle 25G | BD | 300600 | |
Paper tape tesa | Tesa | NA | |
Parafilm | Bemis | PM-994 | semi-transparent tape |
Razor blades | Supermax stainless steel | Other brands available | |
Rectal probe | Kent Scientific | 20250-91 | |
Rimadyl Cattle (carprofen) | Zoetis B.V | Registration# REG NL 10130 | |
Student Fine Scissors Straight 11.5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | Used to cut gauze |
Surgical instrument cleaner | Roboz | IC-1000 | |
Surgical instrument lubricant | Roboz | IL-1000 | |
Syringes (1 ml) | BD | 303172 | Other brands available |
Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Indivior UK Limited/Reckitt Benckiser Healthcare | Registration# RVG 08725 | |
Vicryl polyglactin suture 5-0 FS-2 needle | Ethicon | V292ZH | |
VirkonS | Bio-services | antiseptic solution | |
Wooden cotton swab (sterile) | Klinion | 531530 | Other brands available |