Här presenterar vi en metod för att få bilder av tarmen vid laserinducerad sårbildning. Genom att exponera mustarmen för en multifotonlaser induceras förlusten av en enda eller flera kryptor lokalt. Genom att upprepade gånger avbilda det skadade området under månader fångas realtidsdynamiken i tarmåterhämtningen.
Att undersöka tarmåterhämtning in vivo är en utsökt teknisk utmaning. Brist på longitudinella avbildningsprotokoll har förhindrat djupare insikter i cell- och vävnadsskaldynamiken som orkestrerar tarmregenerering. Här beskriver vi en intravital mikroskopimetod som lokalt inducerar vävnadsskada på en enda kryptskala och följer tarmepitelets regenerativa respons hos levande möss. Enstaka kryptor eller större tarmfält ablerades av en högintensiv multifotoninfraröd laser på ett tids- och rymdkontrollerat sätt. Efterföljande långvarig repetitiv intravital avbildning möjliggjorde spårning av de skadade områdena över tid och möjliggjorde övervakning av kryptdynamik under vävnadsåtervinning under en period av flera veckor. Kryptombyggnadshändelser som kryptklyvning, fusion och försvinnande observerades i den närliggande vävnaden vid laserinducerad skada. Detta protokoll möjliggör studier av kryptdynamik både i homeostatiska och patofysiologiska inställningar, såsom åldrande och tumörinitiering.
Tarmens epitelfoder utmanas ständigt av magsyror, toxiner och mikrobiota som kan orsaka störningar i epitelbarriären. Tarmstruktur och vävnadsorganisation är specialiserade för att ständigt självförnya och reparera skador. Tunntarmens enkelskiktade epitel är organiserat i krypt-villusenheter1. Vid homeostas ger självförnyande Lgr5+ intestinala stamceller som finns vid basen av kryptan upphov till differentierad avkomma. De differentierade dottercellerna reser till spetsen av villusaxeln på ett transportbandssätt, där de kastas så att tarmfodret fylls på 3-5 dagar 2,3. På lång sikt bidrar inte alla Lgr5+-celler lika mycket till vävnadsförnyelse, eftersom detta också beror på cellernas förmåga att röra sig mot transportbandet mot kryptans bas (dvs. retrograd rörelse)4,5. Vid ablation av Lgr5+ celler genom exempelvis strålning flyttar stamceller utanför kryptans bas in i basen för att dedifferentiera och fylla på stamcellspoolen 6,7,8.
Akut inflammation kan orsaka förlust av Lgr5+ stamceller 9,10. Förutom stamcellsförlust kan många yttre faktorer orsaka akut skada på epitelet på kryptskalan. Strålning, kemiska behandlingar och antibiotika har visat sig skada tarmkrypter och villi11. Större fält av krypter och villi kan påverkas av bakteriella, virala och parasitiska infektioner12. Tarmen har en anmärkningsvärd förmåga att återhämta sig från inre och yttre skador på kryptskalan genom kryptklyvning (en uppdelning av en krypta i två)13. Vid sårning genomgår krypter i området intill skadan klyvning för att fylla på kryptnumren. Detta fenomen förekommer också, men i mindre utsträckning, under homeostas14,15. För att motverka en potentiell ökning av kryptantalet under homeostas kan krypter också smälta (slå samman två krypter till en)16,17. Huruvida kryptfusion också spelar en roll för att återupprätta kryptnummer efter sårning är okänt. Dessutom återstår dynamiken och regleringsfaktorerna i denna process att klarlägga.
Skademodeller är oumbärliga för att studera vävnadsregenerering in vivo. Olika skademodeller har använts för att studera tarmvävnadsregenerering. Tidigare experimentella strategier använde högdosstrålning för att tömma stamcellspooler18 eller behandling med dextransulfatnatrium (DSS) för att inducera kronisk och akut kolit och kryptförlust hos möss19,20. Encellsablation med genetiska eller optiska medel har använts för att förfina vävnadsskador och anses vara ett attraktivt verktyg för att särskilja stam- och stamcellernas roll 21,22 och studera vaskulär regenerering23. Dessutom har ett biopsiskadesystem utvecklats för att inducera skador i större fält av flera krypter och villi24. Viktigt är att svaret på den skadliga förolämpningen kan variera längs tarmens proximala-distala axel, som rapporterats för strålning, vilket orsakade mer skada i tunntarmen än i tjocktarmen25. Detta belyser behovet av riktade metoder som kontrollerar både omfattningen av den skadliga förolämpningen och dess lokalisering i tarmkanalen.
Skadeomfattning och återhämtning har konventionellt bedömts med statiska medel, vilket ger begränsad information om dynamiken i vävnadsåtervinning. Intravital mikroskopi (IVM) har öppnat unika möjligheter att kvantifiera stamcellsbeteende, epitelremodellering och regenerering i många organ 26,27,28,29,30, och har gett effektfulla insikter i tarmbiologi 4,5,21,31,32,33,34, 35,36.
Här beskriver vi en metod för att orsaka spatiotemporalt definierad tarmskada och fånga återhämtningen av tarmepitelslemhinnan. Vi använder två fotonbaserade laserablationer för att skada tarmkrypter och följer den omedelbara sårresponsen och den långsiktiga återhämtningen genom repetitiv intravital mikroskopi. Vårt protokoll gör det möjligt att kartlägga den regenerativa ombyggnaden av tarmvävnadsarkitekturen som svar på lokal vävnadsskada. Kryptdynamik, inklusive fissions- och fusionshändelser, kan lätt kvantifieras och spåras över tiden. Tillämpningen av laserablation och repetitiv intravital avbildning kan användas som en plattform för att undersöka vävnadsskaldynamiken i tarmarkitekturen under homeostas och patofysiologi, såsom tumörinitiering.
Detta protokoll kombinerar mikroskopisk laserablation och longitudinell intravital mikroskopi för att följa tarmregenerering från tidigt skadesvar till långvarig vävnadsremodellering. Tekniken har etablerats i strikt överensstämmelse med etiska överväganden för att inducera och avbilda mikroskopisk laserablation, och när den följs exakt kommer den att upprätthålla djurens välbefinnande. Under operationen är det viktigt att se till att tarmens integritet är väl bevarad. Detta kan uppnås genom att försiktigt hantera vävnaden med sterila våta bomullspinne, vilket förhindrar blödning eller uttorkning av vävnaden. Omfattningen av laserinducerad mikroskopisk skada bör också bedömas noggrant genom att avbilda de olika tarmskikten i området efter laserablation. Om forskaren vill anpassa frekvensen av de försökssteg som beskrivs i detta protokoll, bör institutets djurförsöksetiska kommitté rådfrågas före försöket för att fastställa konsekvenserna för välbefinnandet.
Repetitiv intravital mikroskopi gör det möjligt att övervaka vävnadsåtervinning i samma mus över tiden. Upprepad kirurgisk exponering av tarmen ger lätt optisk tillgång till hela tarmkanalen. Vävnadens inneboende egenskaper, såsom vaskulaturen, fungerar som landmärken för att identifiera samma tarmregioner i varje bildsession. Således kan samma vävnadsregion avbildas under flera veckor, vilket gör det möjligt att kvantifiera långvarig vävnadsregenerering i samma tarmområde i samma mus. Den spatiotemporala kontrollen som erbjuds av den kombinerade kirurgiska och avbildningsmetoden ger fördelen att samma organ kan avbildas under både homeostatiska och regenererande förhållanden i samma mus, vilket står i kontrast till tidigare helorganskademodeller där kontroller och regenererande prover härstammar från olika möss 11,12,18,19,20 . Därför minimerar vår experimentella inställning det nödvändiga antalet djur som behövs för experimentet och minskar variationen inom djur.
Protokollfelsökning bör börja med en genomgång av mus- och tarmhanteringstekniken och en kontroll av mikroskopiutrustning och inställningar. Det finns många kritiska steg i detta protokoll som kräver extra uppmärksamhet. För det första, för att säkerställa djurens välbefinnande och kontinuerlig hög datakvalitet, måste allt arbete utföras i en ren steril miljö med aseptisk teknik, och mustemperaturen bör bibehållas under operationen och varje bildbehandling. Att hålla vävnaden hydratiserad med steril, förvärmd saltlösning under avbildning är viktigt och förhindrar vävnadsfibros.
För att säkerställa att experimentet utförs på ett reproducerbart sätt är det viktigt att rikta in lasrarna före användning för optimal inlärning och att mäta effekten från multifotonlasern i början av varje session. Parametrar som typ av objektiv, förstoring, uppehållstid, lasereffekt och våglängd påverkar omfattningen av mikroskopisk laserablation och bör beaktas. I denna studie utförs både laserablation och avbildning med en lasereffekt på 1,2 W (ut ur linsen) vid en våglängd på 960 nm genom ett Fluotar VISIR 25x/0,95 WATER-mål. Ändring av våglängd eller optiska skanningsegenskaper påverkar omfattningen av mikroskopiska skador. En lägre våglängd (t.ex. 840 nm) innebär fotoner med högre energi och ofta i en högre utmatning från lasern och kan förbättra mikroskopisk skada. En högre zoom resulterar i mer energi per region, och därför mindre tid att ablatera krypter och vice versa. Pixelns uppehållstid kan också ökas eller minskas för att ändra ablationshastigheten och skadans omfattning. När den avbildade vävnaden inte är stabil (t.ex. på grund av peristaltiska rörelser) måste ablation utföras snabbt. För detta ändamål bör ablationshastigheten optimeras genom att till exempel öka zoomen och/eller laserutgången.
Att hitta samma tarmregion under flera bildsessioner är ett annat kritiskt steg som måste utföras korrekt för att säkerställa experimentets framgång. För att göra det måste tarmen placeras på exakt samma sätt vid alla tidpunkter. Vi rekommenderar att alltid använda blindtarmen som referenspunkt för att hitta samma regioner i tunntarmen och tjocktarmen. Att försiktigt sträcka vävnaden av intresse med bomullspinne säkerställer att regionen av intresse ligger inom räckvidden för det objektiva arbetsavståndet och maximerar antalet regioner som kan spåras tillbaka. Dessutom rekommenderar vi att du alltid ablaterar och avbildar flera mikroskopiska positioner i varje mus för att ta hänsyn till regioner som kanske inte lokaliseras tillbaka i en senare bildsession. Om regionerna inte kan hittas, även om tarmens positionering är korrekt, kan det hjälpa till att flytta musen och ändra orienteringen av det utsatta området. Att spåra krypter över tid kan vara besvärligt för experiment där större tarmfält i flera intilliggande kryptor ableras. Sådana skadliga förolämpningar kan framkalla vävnadsombyggnad bortom epitelmonoskiktet, vilket kan kulminera i modifiering av vävnadens landmärken som används för spårning av regionen över tiden. Att välja landmärken på tillräckligt avstånd till den skadade platsen och fånga större synfält som överträffar det skadade området med flera hundra mikrometer ökar chansen för framgångsrika långsiktiga experiment. Förutom felaktig positionering av tarmen på mikroskopstadiet kan peristaltiska rörelser i mag-tarmkanalen störa avbildning. Detta problem kan förbättras på två sätt. Om rörelsefrekvensen inte är för hög kan processen upprepas i samma region med ökad exponeringstid. Alternativt kan högre mängder anestesi användas för att minska peristaltiken. Vi rekommenderar att man begränsar högre doser isofluran till korta justeringar. Sammantaget bör bildsessionerna hållas så korta som möjligt, optimalt under 3 timmar, för att säkerställa snabb återhämtning.
Den kombinerade laserablationen och den longitudinella intravitala mikroskopimetoden har flera fördelar jämfört med andra skademodeller. Tidigare (kemiska) skademodeller saknade förmågan att lokalt begränsa den skadliga förolämpningen 6,11,12,19,20. Laserablation övervinner denna brist genom att begränsa skadan till ett definierat område av intresse. Detta gör det möjligt för forskare att kontrollera platsen för skadan, liksom skadans omfattning. Skadornas svårighetsgrad kan moduleras till att ablatera kryptor eller hela mikroskopiska tarmfält för att informera om regenerativa svar på kryptskalan. Förutom rumslig kontroll tillåter laserablation också att exakt tajma skadans början och därigenom överträffa precisionen hos tidigare läkemedels-, kemikalie- och infektionsmodeller 9,10,11,12,19,20. Vårt protokoll bygger vidare på tidigare studier som använt laserinducerad termisk ablation som metod för att inducera lokal skada i tarmen21,23. Tidigare laserinducerade skademodeller avbildade lokala områden i tunntarmen21 eller luminalytan i distala tjocktarmen23. Den kombinerade kirurgiska och laserablationsmetoden gör det möjligt att visualisera tarmepitelet (krypter i synnerhet) med hög upplösning och att utföra laserablation och uppföljningsavbildning av vävnadsåtervinning i vilken position som helst i tunntarmen, blindtarmen och proximal kolon. Det fångar återhämtningen av samma tarmregioner över tiden, vilket gör det möjligt att visualisera olika lager i tarmen (slemhinna, submucosa, muscularis och serosa) enligt experimentuppställningen. Vår teknik är huvudsakligen skräddarsydd för långvarig upprepad avbildning under en period av flera veckor/månader. För att studera krypternas kortsiktiga återhämtningsdynamik (t.ex. under flera på varandra följande dagar efter skada) kan laserablationsmetoden som beskrivs här kombineras med intravital imaging windows27,28,40.
Detta protokoll kan användas för en mängd forskningsansökningar från olika vetenskapliga områden som spänner över regenerering, immunologi och cancerforskning. Longitudinell avbildning av tarmregenerering belyser den cellulära dynamiken som bevarar epitelintegritet och barriärfunktion, möjliggör värdförsvar mot patogener i tarmlumen och som ligger till grund för clearance och spridning av onkogena mutationer. Varje vetenskaplig fråga kommer att ställa unika krav på omfattningen av laserinducerad skada och varaktigheten av avbildning. Fluorescerande reportermöss och injicerade färgämnen kan drastiskt expandera och förfina de data som kan förvärvas genom att tillåta visualisering av vilken cell och struktur som helst av intresse. Till exempel kan en Lgr5-CreERt2: Rosa26-Confetti-mus användas för att visualisera stamcellsavkommor, medan Rosa26-mTmG-reportern informerar om vävnadsarkitektur. Tillsammans gör dessa senaste tekniska framsteg intravitala tarmexperiment ett lukrativt verktyg för att främja vår förståelse av tarmbiologi och sjukdom.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av Netherlands Organization of Scientific Research NWO (Vici-bidrag 09150182110004 till J.v.R. och Veni-bidrag 09150161910151 till H.A.M), OCENW. GROOT.2019.085 (till J.v.R), och ett EMBO postdoktoralt stipendium (bidrag ALTF 452-2019 till H.A.M).
Anesthesia induction box | Veterinary Technics | ||
Autoclave | Certoclav | ||
Betadine | Mylan | 202809 | |
Diaper (underpad) | Absorin comfort | ||
Dumont forceps | Fine Scientific Tools | 11255-20 or 11272-40 | Inox, style #55, used to hold the peritoneum |
Enzymatic instrument cleaner | Roboz | EC-1000 | |
Ethanol 80% | homemade | NA | |
Eye ointment | Duratears Z (Alcon) | 288/28282-6 | |
Fine Scissors Straight 9 cm | Fine Scientific Tools | 14060-09 | Used to cut skin and peritoneum of the mouse |
Gauze 5 cmX5 cm | Cutisoft (Bsn medical) | 45847-00 | |
Graefe Forceps Curved Serrated | Fine Scientific Tools | 11051-10 | Used to hold the skin |
Hartman Hemostat Straight | Fine Scientific Tools | 13002-10 | Used for suturing |
Heating pad | Comfort | T5-5000 | |
Imaging box | Custom made | ||
Incision film | Nobafilm | 172215 | |
Inverted multi-photon microscope with automated stage | Leica Microsystems | NA | |
Isoflurane (vetflurane) | Pharmachemie BV, Haarlem, Netherlands | 305788 | |
Isoflurane vaporizer | Penlon sigma delta | ||
Micropore paper tape | Micropore | ||
NaCl 0.9% | Braun | Other brands available | |
Needle 25G | BD | 300600 | |
Paper tape tesa | Tesa | NA | |
Parafilm | Bemis | PM-994 | semi-transparent tape |
Razor blades | Supermax stainless steel | Other brands available | |
Rectal probe | Kent Scientific | 20250-91 | |
Rimadyl Cattle (carprofen) | Zoetis B.V | Registration# REG NL 10130 | |
Student Fine Scissors Straight 11.5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | Used to cut gauze |
Surgical instrument cleaner | Roboz | IC-1000 | |
Surgical instrument lubricant | Roboz | IL-1000 | |
Syringes (1 ml) | BD | 303172 | Other brands available |
Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Indivior UK Limited/Reckitt Benckiser Healthcare | Registration# RVG 08725 | |
Vicryl polyglactin suture 5-0 FS-2 needle | Ethicon | V292ZH | |
VirkonS | Bio-services | antiseptic solution | |
Wooden cotton swab (sterile) | Klinion | 531530 | Other brands available |