Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Мышь in vivo Плацентарная манипуляция CRISPR

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/64760
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 1,2,3,4
1Interdisciplinary Graduate Program in Genetics, University of Iowa, 2Department of Psychiatry, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3Iowa Neuroscience Institute, Carver College of Medicine, University of Iowa, 4Hawk-IDDRC, University of Iowa

Summary

Здесь мы описываем специфический по времени метод эффективного манипулирования критическими путями развития плаценты мыши in vivo. Это выполняется путем инъекции и электропорации плазмид CRISPR в плаценты беременных маток на эмбриональный день 12,5.

Abstract

Плацента является важным органом, который регулирует и поддерживает развитие млекопитающих в утробе матери. Плацента отвечает за передачу питательных веществ и отходов между матерью и плодом, а также за выработку и доставку факторов роста и гормонов. Плацентарные генетические манипуляции у мышей имеют решающее значение для понимания специфической роли плаценты во внутриутробном развитии. Плацентарно-специфические трансгенные мыши, экспрессирующие Cre, имеют различную эффективность, и другие методы манипулирования плацентарными генами могут быть полезными альтернативами. В этой статье описывается метод прямого изменения экспрессии плацентарных генов с использованием манипуляций с генами CRISPR, который может быть использован для модификации экспрессии целевых генов. Используя относительно продвинутый хирургический подход, беременные матери подвергаются лапаротомии на эмбриональный день 12,5 (E12,5), и плазмида CRISPR доставляется стеклянной микропипеткой в отдельные плаценты. Плазмида сразу же подвергается электропорации после каждой инъекции. После восстановления матери плаценты и эмбрионы могут продолжать развитие до оценки в более поздний момент времени. Оценка состояния плаценты и потомства после использования этого метода может определить роль специфической во времени функции плаценты в развитии. Этот тип манипуляции позволит лучше понять, как генетика и функция плаценты влияют на рост и развитие плода в контексте множественных заболеваний.

Introduction

Плацента является важным органом, участвующим в развитии плода. Основная роль плаценты заключается в обеспечении необходимых факторов и регулировании передачи питательных веществ и отходов плоду и от него. Плаценты млекопитающих состоят как из плодной, так и из материнской ткани, которые составляют интерфейс плода и матери, и, таким образом, генетика как матери, так и плода влияет на функцию1. Генетические аномалии или нарушение функции плаценты могут резко изменить развитие плода. Предыдущая работа показала, что генетика и развитие плаценты связаны с измененным развитием определенных систем органов у плода. В частности, аномалии в плаценте связаны с изменениями в мозге, сердце и сосудистой системе плода 2,3,4,5.

Транспорт гормонов, факторов роста и других молекул от плаценты к плоду играет важную роль в развитии плода6. Было показано, что изменение плацентарной продукции определенных молекул может изменить развитие нервной системы. Воспаление матери может увеличить выработку серотонина за счет изменения экспрессии метаболического гена триптофана (TRP) в плаценте, что впоследствии создает накопление серотонина в мозге плода7. Другие исследования обнаружили аномалии плаценты наряду с пороками сердца. Считается, что аномалии в плаценте способствуют врожденным порокам сердца, наиболее распространенному врожденному дефекту у людей8. Недавнее исследование выявило несколько генов, которые имеют сходные клеточные пути как в плаценте, так и в сердце. Если эти пути нарушены, они могут вызвать дефекты в обоих органах9. Дефекты плаценты могут усугубить врожденные пороки сердца. Роль генетики и функции плаценты в развитии специфической системы органов плода является новой областью исследований.

У мышей есть гемохориальная плацента и другие особенности плаценты человека, что делает их очень полезными моделями для изучения заболеваний человека1. Несмотря на важность плаценты, в настоящее время отсутствуют целенаправленные генетические манипуляции in vivo. Кроме того, в настоящее время существует больше вариантов нокаутов или нокдаунов, чем манипуляции с чрезмерной экспрессией или усилением функции в плаценте10. Существует несколько трансгенных линий, экспрессирующих Cre, для плацентарно-специфических манипуляций, каждая из которых находится в разных линиях трофобласта в разные моменты времени. К ним относятся Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER и Gcm1-Cre11,12,13,14. Хотя эти трансгены Cre эффективны, они могут быть не способны манипулировать некоторыми генами в определенные моменты времени. Другим широко используемым методом нокаута или сверхэкспрессии экспрессии плацентарных генов является встраивание лентивирусных векторов в культуру бластоцисты, что вызывает специфическую для трофобласта генетическую манипуляцию15,16. Этот метод позволяет добиться устойчивого изменения экспрессии плацентарных генов на ранних стадиях развития. Использование РНК-интерференции in vivo редко используется в плаценте. Вставка плазмид шРНК может быть выполнена аналогично методу CRIPSR, описанному в этой статье. Это было сделано на E13.5 для успешного снижения экспрессии PlGF в плаценте, что влияет на сосудистую сеть мозгапотомства 17.

В дополнение к методам, которые в основном используются для нокаута или нокдауна, индуцирование сверхэкспрессии обычно выполняется с помощью аденовирусов или введения экзогенного белка. Методы, используемые для сверхэкспрессии, имеют разную степень успеха и в основном выполняются на более поздних сроках беременности. Для изучения роли инсулиноподобного фактора роста 1 (ИФР-1) в функции плаценты был проведен аденовирально-опосредованный перенос плацентарного гена для индуцирования сверхэкспрессии гена IGF-1 18,19. Это было выполнено на поздних сроках беременности мыши на E18.5 с помощью прямой плацентарной инъекции. Чтобы предоставить дополнительные возможности и обойти возможные неудачи установленных плацентарных генетических манипуляций, таких как сбои комбинации Cre-Lox, возможная токсичность аденовирусов и нецелевые эффекты шРНК, можно использовать прямые манипуляции CRISPR с плацентой in vivo 20,21,22. Эта модель была разработана для решения проблемы отсутствия моделей сверхэкспрессии и создания модели с гибкостью.

Этот метод основан на работе Lecuyer et al., в которой плазмиды shRNA и CRISPR были нацелены непосредственно in vivo на плаценты мыши для изменения экспрессии PlGF 17. Этот метод может быть использован для непосредственного изменения экспрессии плацентарных генов с использованием манипуляций CRISPR в несколько моментов времени; для этой работы был выбран Е12.5. Плацента к этому моменту созрела и достаточно велика, чтобы ею можно было манипулировать, что позволяет вставлять специфическую плазмиду CRISPR на E12.5, что может оказать значительное влияние на развитие плода от середины до конца беременности23,24. В отличие от трансгенных подходов, но подобно вирусной индукции или РНК-интерференции, этот метод допускает сверхэкспрессию или нокаут в определенные моменты времени с использованием относительно продвинутого хирургического подхода, что позволяет избежать возможного нарушения плацентации или эмбриональной летальности из-за более ранних изменений. Поскольку только несколько плацент получают экспериментальную или контрольную плазмиду в помете, подход допускает два типа внутреннего контроля. Этими контрольными элементами являются те, которые вводят и электропорируют соответствующую контрольную плазмиду, и те, которые не подвергаются прямым манипуляциям. Этот метод был оптимизирован для создания сверхэкспрессии гена IGF-1 в плаценте мыши с помощью плазмиды CRISPR синергетического медиатора активации (SAM). Был выбран ген IGF-1, так как IGF-1 является важным гормоном роста, доставляемым плоду, который в основном вырабатывается в плаценте до рождения25,26. Этот новый метод CRISPR, нацеленный на плаценту, позволит проводить прямые манипуляции, чтобы помочь определить связь между функцией плаценты и развитием плода.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры были выполнены в соответствии с федеральными правилами и политикой Университета Айовы и были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию.

1. Животные и животноводство

  1. Держите животных в 12-часовом световом дневном цикле с едой и водой ad libitum.
  2. Используйте CD-1 самок мышей в возрасте 8-15 недель. Используйте наличие копулятивной пробки для идентификации Е0,5.
  3. На Е0,5 поодиночке размещают беременные плотины.

2. Калибровка микропипетки

ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровка микропипетки должна быть выполнена перед операцией, когда это возможно.

  1. Перед изготовлением и калибровкой микропипетки разбавьте все плазмиды до рекомендуемой концентрации (0,1 мкг/мкл) в воде, не содержащей ДНКазы. Смешайте плазмиду с соответствующим образом разбавленным красителем Fast Green (1 мкг/мкл в PBS) (конечная концентрация плазмиды: 0,06 мкг/мкл).
  2. Вытягивайте микропипетки с помощью стеклянных капилляров диаметром 10 см с наружным диаметром 1,5 мм и внутренним диаметром 0,86 мм с помощью съемника микропипеток.
  3. Аккуратно отломите кончик микропипетки (2-3 мм) стерильными щипцами.
  4. Загрузите микропипетку в микрокапиллярный наконечник, прикрепленный к микроинжектору. Убедитесь, что микроинжектор подключен к машине для микроинъекций и что уровень азота достаточен для калибровки микропипетки.
  5. После того, как микропипетка прикреплена к микроинжектору, загрузите в нее раствор красителя Fast Green для выполнения калибровки (1 мкг/мкл в PBS). Откалибруйте микропипетку для введения объема примерно 3,5 мкл. Опорожните («очистите») микропипетку, готовясь к загрузке плазмидных растворов, как показано ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая микропипетка будет немного отличаться. Чтобы избежать повреждения плаценты во время инъекции, время инъекции следует установить в пределах 0,5-1,5 с. Давление должно быть установлено в пределах 1-8,5 фунтов на квадратный дюйм. Откалибруйте каждую микропипетку отдельно; Если микропипетка не может быть откалибрована в рамках этих параметров, то ее не следует использовать.

3. Хирургия (рис. 1А)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для подготовки очистите поверхности как подготовительной, так и хирургической областей 70% этанолом. Поместите впитывающую подкладку в зону подготовки. В области хирургии положите грелку вниз, а затем положите поверх нее впитывающую подкладку. Стерилизуйте все инструменты перед операцией. Время нахождения плотины под наркозом должно составлять менее 1 часа.

  1. Обезболивание
    1. Введите 5 мг / кг НПВП (мелоксикама) или другого одобренного анальгетика беременной женщине за 30 минут до 1 часа до операции.
    2. Поместите беременную мать в индукционную камеру, прикрепленную к испарителю изофлурана.
    3. Установите испаритель на 4% изофлурана и 3,5 л/мин кислорода.
    4. После того, как анестезия будет подтверждена отсутствием реакции на защемление пальца ноги и снижением частоты дыхания, удалите плотину из индукционной камеры в область подготовки.
  2. Подготовка к операции
    1. В зоне подготовки поместите плотину на спину с носовым конусом.
    2. Уменьшите содержание испарителя до 2% изофлурана и 3,5 л/мин кислорода, пока плотина находится в носовом обтекателе.
    3. Тщательно побрейте брюшко плотины и удалите лишнюю шерсть. Поочередно покрывайте бритый живот раствором повидона и 70% этанола три раза, используя стерильные аппликаторы с ватными наконечниками. Нанесите последний слой раствора повидона. Чтобы предотвратить высыхание роговицы, нанесите искусственный слезный гель на оба глаза плотины (рис. 2A, B).
    4. После подготовки переместите плотину с носовым конусом в назначенную операционную зону.
  3. Лапаротомия матки
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стерильные перчатки на протяжении всей хирургической процедуры. Смените перчатки при контакте с какой-либо нестерильной поверхностью.
    1. В области хирургии поместите лежачий лежа на спине и закрепите носовой конус на месте с помощью ленты. Установите грелку под впитывающей прокладкой на 45 °C.
    2. С помощью щипцов и ножниц сделайте разрез кожи примерно на 2 см по средней линии. Используйте щипцы, чтобы наложить палатку на кожу, и сделайте вертикальный разрез на коже. После этого сделайте еще один разрез аналогичного размера через брюшину, чтобы обнажить рога матки. Используя щипцы, заткните брюшину, делая вертикальный разрез (рис. 2C, D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Неспособность правильно наложить палатку при разрезе брюшины может привести к смертельному разрезу кишечника.
    3. Аккуратно помассируйте рога матки через разрез, надавливая по бокам живота. Делайте это, осторожно направляя матку без инструментов, используя только пальцы, чтобы избежать случайной травмы. Поместите обнаженную матку поверх стерильной хирургической простыни, закрывающей брюшную полость матери, и держите ее влажной на протяжении всей операции с помощью капель стерильного физиологического раствора, который можно нагреть до 30 ° C перед использованием по мере необходимости (рис. 2E, F).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рога матки могут быть идентифицированы, как описано в Wang et al.27.
    4. После того, как матка обнажена, выберите три пары плацент для манипуляции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плаценты могут быть идентифицированы, как описано Elmore et al.24. Для максимальной приживаемости эмбрионов следует обрабатывать не более 6 плацент. Если присутствует менее 12 эмбрионов, следует вводить не более 4 плацент. Выберите две соседние плаценты так, чтобы одна получила контрольную инъекцию, а другая — экспериментальную плазмиду. Использование двух соседних плацент позволяет лучше сравнивать плаценты в аналогичных местах матки, а также обеспечивает повышенную выживаемость. Выбранные плацентарные пары выбираются случайным образом и располагаются по обоим рогам матки (рис. 1B).
    5. Запишите расположение плацентарных манипуляций и организацию эмбрионов в рогах матки, чтобы эмбрионы и плаценты можно было идентифицировать во время сбора, так как одна мать будет нести как контрольные, так и экспериментально обработанные плаценты/эмбрионы.
  4. Плацентарная инъекция и электропорация контрольной плазмиды
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания асептической техники перед использованием стерилизуйте электропорационные лопасти и микроинжектор холодным стерилизующим средством. Смените перчатки при контакте с какой-либо нестерильной поверхностью.
    1. Используя калиброванную микропипетку, загрузите достаточное количество соответствующей контрольной плазмиды для трех инъекций. Выполните все инъекции на глубине ~0,5 мм латерально в плаценту между децидуа (белая) и соединительной зоной (темно-красная) (рис. 3A-F).
    2. Выполняют инъекции в три контрольные плаценты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все контрольные инъекции плазмиды перед экспериментальными инъекциями, чтобы избежать перекрестного загрязнения плазмид микропипеткой. Это позволит использовать одну и ту же микропипетку, так как смена микропипеток и время калибровки резко увеличивают время операции и снижают выживаемость матери.
    3. Проведите электропорацию контрольной плазмиды плаценты в течение 2 мин после инъекции.
    4. Для электропорации используйте пару лопастей диаметром 3 мм, прикрепленных к электропорационной машине. Чтобы обеспечить эффективность включения CRISPR и жизнеспособность эмбрионов, используйте следующие настройки электропорации: 2 импульса, 30 В, импульс 30 мс, импульс 970 мс выключен, униполярный.
    5. После инъекции, но непосредственно перед электропорацией, покройте места контакта стерильным физиологическим раствором, нанося физиологический раствор точно на три участка на стенке матки и лопатки с помощью капельницы или шприца.
    6. Аккуратно надавите на лопатки электропорации на боковых сторонах плаценты. Поместите лопасть анода над местом впрыска и катодом прямо напротив (рис. 4A-C).
    7. Нажмите на импульс на электропорационной машине и дождитесь завершения двух импульсов, прежде чем снимать электропорационные лепестки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшое количество белой пены часто наблюдается между лопатками и плацентой во время импульсов. Если этого не произошло, перед дальнейшим использованием проверьте напряжение на лопастях вольтметром. Если показания вольтметра не совпадают с настройкой напряжения электропорации, лопасти не работают.
  5. Плацентарная инъекция и электропорация экспериментальной плазмиды
    1. Следуйте тем же инструкциям, что и на шаге 3.4.1. к этапу 3.4.2. использование экспериментальной плазмиды вместо контрольной плазмиды.
    2. Проведите электропорацию всех трех экспериментальных инъецированных плацент в течение 2 минут после инъекции. Это следует выполнять так же, как и для тех, кому вводят контрольные плазмиды. Выполните шаг 3.4.4. к этапу 3.4.7.
  6. Завершение операции
    1. После завершения манипуляций с плацентой аккуратно помассируйте рога матки обратно внутрь брюшной полости, используя только пальцы (рис. 5А).
    2. Во-первых, выполните двойные одиночные швы на брюшинном слое, используя рассасывающиеся швы с покрытием и плетеными рассасывающимися швами длиной 45 см игольчатым сплавом 13 мм 3/8c. Разместите швы на расстоянии 2-3 мм друг от друга (рис. 5B).
    3. После наложения швов на слой брюшины наложите швы на кожу рассасывающимися швами. Тройной узел одинарных швов на расстоянии 2-3 мм друг от друга, чтобы гарантировать, что плотина не сможет расстегнуть шов (рис. 5C).
    4. После завершения наложения швов установите изофлуран на 1%, а кислород на 3,5 л / мин и нанесите тканевый клей на швы на коже (рис. 5D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тканевый клей не является обязательным, но рекомендуется для предотвращения повторного открытия разреза из-за жевания плотины.
    5. Когда тканевый клей высохнет, выключите испаритель и удалите плотину из области операции. Поместите плотину в поддерживающую клетку на спине.

4. Послеоперационный уход и наблюдение

  1. Дайте беременной матери восстановиться в чистой клетке под наблюдением в течение как минимум 30 минут, чтобы избежать немедленных осложнений операции. Наблюдайте до тех пор, пока он не станет полностью амбулаторным и не сможет перевернуться на ноги без посторонней помощи. Одиночный дом плотины после операции.
  2. Следите за послеоперационным уходом и наблюдением в учреждении до сбора эмбрионов. Записывайте вес плотины и ежедневно контролируйте швы и место разреза.

5. Сбор плаценты E14.5

  1. На E14.5 глубоко обезболите плотину коктейлем кетамин/ксилазин (1 мг/мл кетамина и 0,1 мг/мл ксилазина), а затем цервикально вывихните плотину.
  2. Сделайте ножницами V-образный надрез в брюшной полости плотины, а матку извлеките. Сразу же выложите на 5-сантиметровую чашку Петри со льдом. С помощью щипцов аккуратно извлеките эмбрион и соответствующую плаценту из матки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ведите учет расположения эмбриона и соответствующей плаценты в рогах матки, чтобы определить, какая из них подверглась непосредственной манипуляции во время операции.
  3. Запишите вес плаценты. Используя щипцы и бритвы без РНК, разрежьте плаценту пополам по средней линии. Положите одну половину в 4% PFA при 4 ° C. Разрежьте оставшуюся половину пополам и храните оставшиеся две четверти при температуре -80 ° C в двух пробирках, одна из которых содержит реагент для хранения РНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы и другие материнские ткани можно хранить из коллекции при температуре -80 °C для использования в будущем.

6. Анализ экспрессии плацентарных генов

  1. Используйте четверть плаценты, хранящуюся при -80 ° C в реагенте для хранения РНК.
  2. Обработайте плаценты для кПЦР, как описано в Elser et al., используя метод Trizol для выделения РНК, спектрофотометр для определения концентрации РНК, набор для синтеза кДНК и кПЦР с помощью SYBR Green Master Mix28. Вместо набора ДНК Turbo DNAfree, упомянутого в Elser et al., используйте набор RNAcleanup после выделения РНК Trizol, чтобы убедиться, что образцы не содержат загрязняющих веществ28.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прочтите паспорт безопасности материала (MSDS) для тризола и используйте его в химическом вытяжном шкафу.
  3. Оцените плазмидную вставку контрольной плазмиды с праймерами GFP и экспериментальной плазмиды с праймерами BLAST (праймеры перечислены в дополнительной таблице 1). Используйте значение КТ, чтобы определить наличие плазмиды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значения КТ выше 35 являются ложноположительными, и только те, которые ниже 35, следует считать положительным показателем того, что плазмида была успешно вставлена.
  4. Оцените экспрессию плаценты IGF-1 , нормализованную к гену 18 домашнего хозяйства (праймеры перечислены в дополнительной таблице 1). Используйте метод ddCT для расчета изменения сгиба, а затем рассчитайте нормализованное изменение сгиба экспериментальных образцов на среднее изменение сгиба контрольных образцов.

7. Анализ уровня плацентарного белка

  1. Используйте четверть плаценты, которая хранилась при -80 ° C. Гомогенизируют ткань в буферном растворе, состоящем из 11,5 мМ Tris HCl, 5 мМMgCl2 и 10 мМ ингибитора протеазы в diH2O с конечным рН 7,4. Используйте ручной гомогенизатор и пестик, чтобы разбить ткань.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образец не должен превышать 10% от объема буфера.
  2. Разбавьте гомогенизированные образцы в буфере в соотношении 1:12 так, чтобы они находились в пределах обнаруживаемого диапазона набора для анализа бицинхониновой кислоты (BCA). Выполните анализ BCA в соответствии с инструкциями производителя и количественно определите общий белок с помощью планшетного считывателя.
  3. После проведения анализа BCA нормализуйте все образцы до одинаковой концентрации общего белка 2 мг / мл для ИФА IGF-1, как это было сделано в Gumusoglu et al.29.
  4. Выполните ИФА ИФР-1 в соответствии с инструкциями производителя и количественно определите уровни белка ИФР-1 с помощью считывателя планшетов, используя стандартную кривую концентрации.

8. Пространственная верификация CRIPSR с использованием флуоресцентной гибридизационной маркировки in situ

  1. После того, как половинки плаценты будут надлежащим образом зафиксированы в 4% PFA при 4 ° C в течение 1-3 дней, переместите их в 20% сахарозу при 4 ° C, прежде чем заморозить их в смеси с оптимальной температурой резки (OCT).
  2. Последовательно разделите плаценту, встроенную в ОКТ, в криостате -20 °C на срезы по 10 мкм и поместите их на предметные стекла для маркировки. Разделите плаценту пополам так, чтобы были видны все три субрегиона. Храните предметные стекла при температуре -80 °C до использования для гибридизации in situ .
  3. Выполняйте маркировку флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) в соответствии с протоколами производителя. Гибридизуйте один слайд с зондом dCas9-3xNLS-VP64 и второй «сестринский» слайд той же плаценты с зондом Prl8a8.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Зонд dCas9-3xNLS-VP64 обнаруживает присутствие плазмиды сверхэкспрессии. Зонд Prl8a8 выделяет спонгиотрофобласты соединительной зоны, что позволяет идентифицировать субрегионы плаценты. Эти два зонда помечены на отдельных «сестринских» предметных стеклах, чтобы избежать интерференции многоканальной флуоресценции с зеленой автофлуоресценцией в плацентах.
  4. Пометьте оба зонда детектирующим красителем (Opal 620). После выполнения протокола производителя для FISH нанесите монтажную среду DAPI и поместите покровное стекло на предметное стекло. Запечатайте покровное стекло прозрачным лаком для ногтей.
  5. Изобразите слайды на вертикальном составном флуоресцентном микроскопе и обработайте их с помощью соответствующего программного обеспечения для обработки изображений. Здесь использовалось программное обеспечение CellSens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Общие результаты процедуры (рис. 6)
В исследовании было три манипулируемые группы. К ним относятся плаценты, которым вводили общую контрольную плазмиду CRISPR Cas9 (Cas9 Control), контрольную плазмиду CRISPR активации (Act Control) или активационную плазмиду IGF-1 SAM (Igf1-OE). Cas9 Control лучше подходит для нокаутирующих плазмид, а контроль активации лучше подходит для плазмид с гиперэкспрессией/активацией. Для оценки изменений жизнеспособности, вызванных манипулированием плацентами с помощью инъекций и электропорации, выживаемость эмбрионов в помете была проанализирована на E14.5 (рис. 6A). Этот временной момент был выбран, так как другие исследования, в которых проводилась вставка плазмид CRISPR in vivo с использованием электропорации, показали, что изменения экспрессии могут быть достигнуты в течение 8-22 ч30,31,32. Сбор в E14.5 позволяет плазмиде CRISPR примерно через 48 часов интегрировать и активировать увеличение экспрессии генов. Было обнаружено, что хирургические манипуляции с плотиной повлияли на выживаемость всех эмбрионов, но эмбрионы, связанные с манипулируемыми плацентами, которые подверглись инъекции и электропорации, значительно снизили выживаемость. Выживаемость необработанных эмбрионов (в том же помете, но не подвергающихся целенаправленным манипуляциям) была снижена со 100% выживаемости в среднем до 79,05%. Наблюдалось значительное снижение выживаемости манипулируемых эмбрионов, при этом средняя выживаемость составила 55,56%. Не было обнаружено существенной разницы между тремя манипулируемыми группами.

Чтобы определить, произошли ли значительные грубые изменения в манипулируемых плацентах, был зарегистрирован вес плаценты. Не было существенной разницы в весе плаценты в какой-либо группе (рис. 6B), а общий вид плаценты и эмбриона не изменился. Репрезентативные постнекроскопические изображения были получены на диссекционном микроскопе при сборе на E14.5. Были сделаны изображения плацент/эмбрионов из разных групп лечения, все в одном помете. Не было заметных повреждений или изменений в фенотипическом внешнем виде ни в одной из групп лечения ни в амниотическом мешке, ни в подвергшемся воздействию эмбрионе и соответствующей плаценте (рис. 6D-I). Хотя не было обнаружено серьезных различий в морфологии манипулируемых групп с использованием плазмиды активации IGF-1, это может быть не так для других экспериментальных плазмид, нацеленных на другие гены, которые могут более существенно влиять на основные регуляторы роста и функции плаценты или эмбриона. Не было обнаружено никаких различий в каких-либо показателях между контрольными плацентами Cas9 и контрольными плацентами. Таким образом, эти две группы были объединены и названы «Против» или «Контроль» для всех анализов. Эти результаты демонстрируют, что манипуляции с плацентами внутриутробно на Е12.5 с использованием этой методики вызывают снижение выживаемости эмбриона, но все же существует значительная жизнеспособность. Результаты также показывают, что рост плаценты в целом существенно не пострадал, так как не было значительных изменений в весе между манипулируемыми и необработанными плацентами. Это демонстрирует, что предлагаемый метод может обеспечить выживание здоровых и жизнеспособных плацент, манипулируемых CRISPR, и соответствующих им эмбрионов.

Изменение массы матери регистрировалось каждый день после операции до сбора эмбрионов на E14.5 (рис. 6C). Операция проводилась на E12.5, поэтому все изменения веса плотины указаны относительно веса на E12.5. Экспериментальные (Exp) плотины подвергались плацентарным манипуляциям, тогда как фиктивные плотины подвергались анестезии и лапаротомии аналогичной продолжительности без плацентарных манипуляций. У многих беременных женщин наблюдалось небольшое снижение или отсутствие изменений в весе на следующий день после процедуры (E13.5); Вероятно, это было связано с нарушением приема пищи во время и на короткое время после операции. Большинство плотин показали увеличение веса на E14.5, но иногда снижение веса все же наблюдалось. Отслеживание веса материнской матери после операции позволило контролировать выживаемость эмбрионов. Различия между весом беременных женщин после операции были обычным явлением и не указывали на то, что все обработанные эмбрионы были потеряны. Не было существенных различий в послеоперационных изменениях веса в фиктивных и экспериментальных плотинах. Это свидетельствует о том, что самочувствие матери в целом сохранялось после введения плазмид CRISPR в плаценту. В целом, это показывает, что, хотя этот хирургический метод может вызвать снижение жизнеспособности эмбрионов, он по-прежнему дает значительный процент здорового потомства, которое может быть использовано для исследования.

Анализ экспрессии и включения CRISPR в плаценту E14.5 (рис. 7)
Чтобы определить, была ли клеточная вставка активационной плазмиды IGF-1 успешной для сверхэкспрессии IGF-1, была проведена кПЦР. Как и ожидалось, кПЦР показала значительное увеличение экспрессии IGF-1 в плацентах IGF1-OE по сравнению с контрольными плацентами, когда изменение складки было нормализовано до экспрессии 18s (t-критерий Уэлча, p = 0,0302) (рис. 7A). Чтобы определить, были ли изменены уровни белка IGF-1, был проведен ИФА на плацентах из всех групп. В соответствии с кПЦР, оценка ИФА плаценты E14.5 показала значительное увеличение уровня белка IGF-1 в плаценте IGF1-OE по сравнению с контрольными плацентами (t-критерий Уэлча, p = 0,0469) (рис. 7B). КПЦР и ИФА показали, что сверхэкспрессия плазмиды успешно увеличивает экспрессию гена IGF-1 и продукцию белка IGF-1 соответственно.

Чтобы убедиться, что доставка плазмиды была специфичной для манипулируемых плацент, была проведена кПЦР для специфической активационной плазмиды IGF-1 и контрольной плазмиды CRISPR Cas9. Эти кПЦР были выполнены как на манипулируемых плацентах, так и на необработанных плацентах, которые были рядом с теми, которые были введены. Праймеры для кПЦР, используемые для оценки экспрессии активационной плазмиды, были нацелены на последовательность плазмиды BLAST, которая является частью системы активации (рис. 7C). Необработанные плаценты не показали присутствия плазмиды BLAST (порог цикла [КТ] не определен, обозначен как 40 на графике), а плаценты Igf1-OE показали КТ около 30. КПЦР, проводимая для оценки экспрессии контрольной плазмиды, была нацелена на последовательность из вставленного гена GFP (рис. 7D). Необработанные плаценты показали значения КТ более 35, вероятно, вызванные димеризацией праймера, поскольку эти значения находятся за пределами ожидаемого диапазона экспрессии. Контрольная группа показала значение КТ примерно 30. Эти кПЦР служат проверкой качества, чтобы продемонстрировать ожидаемую сверхэкспрессию IGF-1 или ее отсутствие, а также то, что плазмиды присутствуют только в ожидаемых манипулируемых плацентах.

Пространственную верификацию активационной плазмиды IGF-1 проводили с помощью плацентарных срезов. Плаценты, которые были зафиксированы и заморожены в соединении ОКТ, были последовательно разделены на 10 мкм на предметных стеклах, чтобы все слои были видны. Затем предметные стекла замораживали при -80 ° C до использования для маркировки FISH. Чтобы проверить, где в плаценте была включена активационная плазмида CRISPR IGF-1, использовался зонд dCas9-3xNLS-VP64 с красной флуоресцентной меткой. Этот зонд нацелен на функциональный компонент системы активации. Зеленая автофлуоресценция была использована для демонстрации субрегионов плацентарного интерфейса матери и плода (рис. 7E, F). В необработанных плацентах не было обнаружено dCas9-3xNLS-VP64, так как они не были обработаны манипуляциями CRISPR (рис. 7E). Как и ожидалось, плаценты IGF1-OE имели маркировку dCas9-3xNLS-VP64, как показано красным цветом (рис. 7F). Включение CRISPR было обнаружено во всех трех субрегионах плаценты с наиболее четкой маркировкой соединительной зоны (рис. 7E). Интенсивность флуоресценции мечения dCas9-3xNLS-VP64 варьировалась в зависимости от плаценты, обработанной плазмидой, что указывает на то, что некоторые из них экспрессировали плазмиду сильнее, чем другие, и были различия в точном местоположении/степени маркировки, но маркировка обычно присутствовала во всех субрегионах. Чтобы подтвердить местоположение маркировки dCas9-3xNLS-VP64, была выполнена маркировка Prl8a8 FISH, нацеленная на спонгиотрофобласты, для маркировки субрегиона среднего соединения (рис. 7G, H). Это было выполнено в соседних срезах из той же плаценты на «сестринском» слайде срезов, которые были помечены для dCas9-3xNLS-VP64. Как и ожидалось, структура, указанная маркировкой Prl8a8, была одинаковой между IGF1-OE и необработанными плацентами. Зона децидуа и лабиринта может быть идентифицирована по синей метке ядер (DAPI), окружающей красную зону соединения (рис. 7G, H). Маркировка FISH dCas9-3xNLS-VP64 прояснила, что плазмида была вставлена во все три субрегиона, и это было подтверждено маркировкой Prl8a8. Результаты маркировки FISH подтвердили, что включение активационной плазмиды IGF-1 прошло успешно, и плазмида не мигрировала в необработанные плаценты.

Figure 1
Рисунок 1: Схема протокола . (А) Упрощенная схема хирургической процедуры. Хронологический порядок основных этапов техники. (B) Схема, показывающая пример манипулируемого расстояния между плацентами в рогах матки. Обе панели были созданы с BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Процедура лапаротомии матки. (A-B) Во время подготовки к операции (A) бритый живот плотины и (B) выбритый участок, покрытый раствором йода. (С-Ж) В области хирургии (C) разрез ~2 см на коже живота и (D) разрез ~2 см на брюшине; Видны кишки. (E) Манипуляции с рогами матки через место разреза. Видны рога матки. (F) Полностью обнаженные рога матки, помещенные на стерильную хирургическую простыню. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Инъекция плазмид CRISPR в плаценту E12.5. (А, Б) Ориентация эмбрионов и плаценты в рогах матки. (A) Косой вид меченого рога матки, показывающий дециду, зоны плода и эмбрион. Пунктирная линия показывает, где должно быть место инъекции. (B) Немаркированный маточный рог из панели А. (С,Д) Вид сбоку микропипетки, вставленной в место инъекции в плаценту. D — децидуа, FZ — зоны плода, E — эмбрион, пунктирная линия — место инъекции. (D) Немаркированное изображение вставки микропипетки с панели С. (Е,Ж) Вид сбоку на краситель в плаценте после инъекции. (E) Маркированное изображение рога матки, демонстрирующее плаценту, в которую была введена плазмида CRIPSR, содержащая видимый краситель, и плацента, которая не была введена. (F) Немаркированное изображение рога матки на панели Е. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Электропорация плаценты Е12.5 после инъекции плазмид CRISPR. (А) Вид сверху плаценты в роге матки. Лопасти для электропорации анода и катода помечены, а белая стрелка указывает на расположение места впрыска. (B) Косой вид электропорации плаценты. (C) Вид сбоку на электропорацию плаценты. (Д-Ж) Упрощенный контур панелей A, B и C. Лопасти анода и катода помечены, P — плацента, E — эмбрион, а немеченая область — матка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Наложение швов на кожу живота и брюшины . (A) Рога матки вернулись в брюшную полость после завершения операции. Видны разрезы кожи живота и брюшины. (B) Разрез брюшины полностью зашивается. (C) Разрез кожи живота полностью зашивается. (D) Нанесение тканевого клея на швы кожи живота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Общие результаты процедуры. (A) Показатели выживаемости эмбрионов после операции, собранные на E14.5, через 2 дня после процедуры. Значительное снижение выживаемости наблюдалось в группах, подвергшихся манипуляциям, по сравнению с необработанными эмбрионами (U-критерий Манна-Уитни: необработанные против контроля Cas9, p = 0,0077; Необработанный по сравнению с контролем действия, p = 0,0330; и необработанный по сравнению с IGF1-OE, p = 0,0032). Достоверных различий в выживаемости манипулируемых групп не наблюдалось (односторонняя ANOVA, p = 0,9454). Каждая точка представляет собой процент выживаемости из одного помета (необработанный n = 22, Cas9 Control n = 9, Act Control n = 13 и IGF1-OE n = 22 помета). (B) Плацентарная масса выживших эмбрионов на E14.5 (односторонняя ANOVA, p = 0,1436) (необработанная n = 138, контрольная Cas9 n = 15, контрольная акция n = 20 и IGF1-OE n = 36 плацент). (C) Изменения веса плотины после операции на E13.5 и E14.5, наблюдаемые у плотин, которые подверглись фиктивной процедуре лапаротомии или подверглись экспериментальным (Exp) плацентарным манипуляциям. Не наблюдается существенной разницы между двумя группами изменений веса плотин после операции (непарные t-критерии: E13,5 p = 0,5452 и E14,5 p = 0,2493) (фиктивные плотины n = 3 и плотины Exp n = 10). Все полосы погрешностей представляют собой SEM. (D-F) Изображения эмбрионов E14.5 после некроскопии в амниотическом мешке с прикрепленной плацентой. (F) Масштабная линейка в крайнем правом углу представляет собой 3,75 мм. (G-I) Косое изображение эмбриона и вид сверху соответствующей плаценты. (I) Масштабная линейка в крайнем правом углу представляет собой 3,75 мм. (D-I) Все метки групп обработки перечислены под изображениями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Анализ экспрессии и включения CRISPR в плаценты E14.5. (A) кПЦР-анализ экспрессии IGF-1 в контроле E14.5 и плацентах IGF1-OE. Достоверное увеличение экспрессии IGF-1, нормализованной к экспрессии 18s, наблюдалось в плацентах IGF1-OE (t-критерий Уэлча, p = 0,0302) (контроль n = 15 и IGF1-OE n = 20 плацент). (B) ИФА уровней белка IGF-1 в контроле E14.5 и плацентах IGF1-OE. Значительное увеличение уровней IGF-1 наблюдалось в плаценте IGF1-OE по сравнению с контрольными уровнями (t-критерий Уэлча, p = 0,0469) (контрольное n = 13 и IGF1-OE n = 15 плацент). (C) кПЦР-анализ последовательности BLAST из плазмиды IGF-1 SAM. Экспрессия BLAST была обнаружена только в плацентах IGF1-OE, а в необработанных плацентах не было обнаружено / неопределенная экспрессия (необработанные n = 4 и IGF1-OE n = 9 плацент). (D) кПЦР-анализ последовательности GFP из контрольной плазмиды CRISPR Cas9. Экспрессия плазмиды была обнаружена в контрольных плацентах, а значения КТ более 35 / ложноположительные результаты были обнаружены в необработанных образцах (необработанные n = 4 и контрольные = 5 плацент). Пунктирной линией обозначен порог ложносрабатывания при 35 CT. Каждая точка данных взята из одной плаценты. Все полосы погрешности представляют собой SEM. (E-H) Флуоресцентная гибридизация in situ плацентарных срезов E14.5 при толщине 10 мкм. (E) Необработанные и (F) IGF1-OE срезы плаценты с зондом dCas9-3xNLS-VP64, помеченным красным цветом. Красный сигнал присутствует только в плаценте IGF1-OE. Зеленый сигнал - это автофлуоресценция, используемая для идентификации плацентарных субрегионов. (G) Необработанные и (H) IGF1-OE срезы плаценты с помощью зонда Prl8a8, помеченного красным цветом, для идентификации спонгиотрофобластов зоны среднего соединения. DAPI синим цветом показаны зоны децидуа и лабиринта, которые окружают эту соединительную зону. (H) Масштабная линейка в крайнем правом углу представляет собой 2 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительная таблица 1: Праймеры, использованные в этом исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Плацента является основным регулятором роста плода, и, как отмечалось ранее, изменения в экспрессии или функции плацентарных генов могут существенно повлиять на развитие плода6. Протокол, изложенный здесь, может быть использован для выполнения целенаправленных манипуляций in vivo CRISPR с плацентой мыши с использованием относительно продвинутого хирургического подхода. Этот метод позволяет получить значительный выход жизнеспособных эмбрионов и соответствующих им плацент, которые могут быть использованы для дальнейшего изучения (рис. 6A, B). Этот метод позволил нам успешно экспрессировать плацентарный IGF-1 на E14.5 (рис. 7A, B). Используемые плазмиды показали специфичность, так как вставленные плазмиды оставались в манипулируемых плацентах и не присутствовали в соседних необработанных плацентах (рис. 7C, D). Пространственное распределение активационной плазмиды IGF-1 было подтверждено FISH для dCas9-3xNLS-VP64 и Prl8a8, что продемонстрировало, что активационная плазмида присутствовала в трех субрегионах плаценты IGF1-OE, а не в каких-либо субрегионах необработанных плацент (рис. 7E-H). Этот метод может быть использован для изменения экспрессии плацентарных генов способами, которые могут быть невозможны с предыдущими методами. Использование этого метода позволит лучше понять влияние экспрессии и функции плацентарных генов на развитие плода в различных контекстах.

Чтобы оптимизировать успех этой процедуры для материнских и внутриутробных исходов, были изучены эффекты изменения нескольких параметров, включая настройки инъекций и электропорации, а также используемые материалы. Для увеличения выживаемости и восстановления матери было установлено, что время под наркозом не должно превышать 1 ч, так как более длительные сроки операции значительно снижают выживаемость. Если время под наркозом достигает примерно 2 часов, вероятность выживания резко снижается до уровня ниже 20%, вероятно, из-за негативных эффектов длительного времени под действием изофлурана. Помимо пребывания под наркозом, наиболее распространенным осложнением операции, которое приводило к материнской смерти, была неспособность должным образом закрыть брюшину при выполнении разрезов кожи и брюшины. Если брюшина не закрыта должным образом, кишечник может быть поврежден, что может привести к смерти в течение нескольких дней после операции. Время, когда матка подвергается воздействию, также влияет на выживание матери и эмбрионов. Среднее время, в течение которого матка подвергалась воздействию в успешных экспериментах, составляло приблизительно 15 минут; Более 30 минут воздействия может привести к увеличению резорбции и возможному заболеванию матери. Открытая матка и любые другие открытые органы (часто кишечник) должны быть влажными, но слишком много физиологического раствора может охладить животное; при периодическом увлажнении оголенных органов следует использовать менее 1 мл стерильного физиологического раствора.

Параметры инъекции и электропорации сильно влияли на выживаемость эмбриона. Объем инъекции не должен превышать приблизительно 4,5 мкл, так как это приводило к резорбции. Время инъекции и давление важны для максимизации выживаемости; Время впрыска должно быть установлено в диапазоне от 0,5 с до 1,5 с, хотя 0,8 с представляется оптимальным. Давление должно быть установлено в пределах 1-8,5 фунтов на квадратный дюйм. Низкие показатели выживаемости эмбрионов наблюдались при низком времени инъекции и высоких уровнях инъекционного PSI. Также было замечено, что если микропипетка будет слишком тупой, может произойти снижение эмбриональной жизнеспособности, и раствор также будет часто вытекать из микропипетки. Тип красителя, используемого для визуализации инъекций, может повлиять на выживаемость. Метиленовый синий приводил к материнской смерти при использовании для этой цели, но фильтрованный раствор красителя Fast Green не оказывал негативного воздействия на здоровье матери. Настройки электропорации были оптимизированы по сравнению с рекомендованными производителем настройками на основе предыдущих исследований электропорации in vivo33. Было обнаружено, что электропорация является манипуляцией, которая нанесла наибольший ущерб и снизила выживаемость эмбрионов. Рекомендуемые настройки электропорации эмбрионов in vivo предполагают четыре импульса для максимизации эффективности CRISPR, но два импульса рекомендуются для более высокой выживаемости33. Было обнаружено, что четыре импульса заставили почти все эмбрионы резорбироваться. Два импульса позволили повысить жизнеспособность при сохранении эффективности CRISPR. Размер электропорационной лопатки также существенно влиял на выживаемость эмбриона. Было обнаружено, что электропорационные лопасти диаметром 5 мм приводили к практически полному рассасыванию при использовании с рекомендуемыми настройками. Действительно, 3-миллиметровые электропорационные лопасти рекомендуются в руководстве производителя и значительно повышают жизнеспособность эмбриона33. Также важно отметить, что многие электропорационные лопасти имеют определенный импульсный срок службы. После того, как они были использованы по максимуму, можно увидеть снижение качества. Это можно выявить, если во время пульса между лопатками и плацентой не образуется мелкая белая пена. Напряжение электропорационной лопасти можно проверить с помощью вольтметра, чтобы определить, производит ли он ожидаемое напряжение.

Это исследование ограничено несколькими способами. Этот метод привязан ко времени и, вероятно, лучше всего выполнять не ранее E10.5 и не позднее E16.5. Это связано с тем, что плацента слишком мала до Е10,5, а после Е16,5 плазмиде может не хватить времени для получения желаемого эффекта. Эти временные рамки означают, что этот метод лучше подходит для определенных типов исследований на мышах. Этот метод полезен для изучения развития нервной системы, так как E12.5 попадает в критический период нейрогенеза для многих структур в мозге34. Этот метод может быть бесполезен для изучения плацентарных воздействий на ранних стадиях развития, таких как образование нервной пластинки, которое происходит на E8.535. Результаты нокаута плазмиды CRISPR в настоящее время неизвестны; Применение этого метода для снижения экспрессии генов нуждается в дальнейшем исследовании, поскольку была продемонстрирована только сверхэкспрессия/активация гена. Несмотря на это, ожидается, что этот метод также будет успешным для введения нокаутной плазмиды CRISPR.

Этот метод также может обеспечить возможность проведения первичной культуры генетически модифицированной плацентарной ткани36. В зависимости от типа используемого CRISPR, такого как CRISPRi и CRISPRa, первичная культура может быть использована для проведения спасательного исследования37,38. Этот метод также может быть использован для дальнейшего изучения связей между генетическими и функциональными аномалиями плаценты и проблемами у потомства. В частности, предыдущее исследование обнаружило значительную корреляцию между показателями геномного риска, специфичными для плаценты, и рисками шизофрении39. Это исследование выявило множество плацентарных генов, которые могут играть роль в развитии шизофрении, которые не были изучены на животных моделях. Эта методика поддается дальнейшим исследованиям этого типа и других.

Знания, полученные в результате модификации плаценты CRISPR, могут быть переведены в ряд различных биомедицинских приложений. Исследования, которые определяют, как специфическая экспрессия генов в плаценте может влиять на развитие плода, могут быть использованы для создания фармакологических вмешательств, направленных на плаценту, которые могли бы лечить эти аномалии. Лечение, направленное непосредственно на плод, может быть трудным и опасным40,41. Плацента является более доступной мишенью для лечения. В случае проблем развития сердца или мозга, которые могут быть изменены внутриутробно, прямые манипуляции с сердцем или мозгом представляют собой высокий риск. Такого риска можно было бы избежать с помощью плацентарного вмешательства, которое является более вероятным и может привести к профилактическим стратегиям нарушений развития нервной системы, для которых молекулярная среда, которая частично обеспечивается плацентой, может иметь решающее значение5. Этот метод также может быть использован для лечения таких заболеваний, как врожденный порок сердца, который связан с плацентарными заболеваниями9. Поскольку врожденный порок сердца является распространенным врожденным дефектом, возможность лечения плацентарным вмешательством может оказать значительное влияние8. Поскольку плацента выполняет множество функций, этот метод может быть использован для продвижения разработки вмешательств при множественных заболеваниях. В целом, этот метод плацентарного нацеливания может быть использован для дальнейшего понимания влияния генетики и функции плаценты на несколько областей развития плода.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам раскрывать нечего.

Acknowledgments

Авторы признают следующие источники финансирования: R01 MH122435, NIH T32GM008629 и NIH T32GM145441. Авторы благодарят лаборатории доктора Вэла Шеффилда и доктора Кельвина Картера в Университете Айовы за использование их операционной комнаты и оборудования, а также доктора Эрика Ван Оттерлоо, доктора Нандакумара Нараянана и доктора Мэтью Вебера за их помощь в микроскопии. Авторы также благодарят доктора Сару Маурер, Майю Эванс и Шрилеху Кунду за их помощь в проведении пилотных операций.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml Tubes USA Scientific Inc 1615-5500
4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS Thermo Fisher Scientific J61899.AP
96 Well plate Cornings 3598 For BCA kit
Absorbent Underpads Fisher Scientific 14-206-62
Activation Control Plasmid Santa Cruz Biotechnology sc-437275 Dnase-free water provided for dilution
AMV Reverse Transcriptase New England Biolabs M0277L Use for cDNA synthesis
Anesthetic Gas Vaporizor Vetamac VAD-601TT VAD-compact vaporizer
Artifical Tear Gel Akorn NDC 59399-162-35
BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23227 Protein quantification
Biovortexer Bellco Glass, Inc. 198050000 Hand-held tissue homogenizer
CellSens Software Olympus V4.1.1 Image processing to FISH images.
Centrifuge 5810 Eppendorf EP022628168 Plate centrifuge
Chloroform Thermo Fisher Scientific J67241-AP RNA isolation
Cotton Tipped Applicators ProAdvantage 77100 Sterilize before use
CRISPR/Cas9 Control Plasmid Santa Cruz Biotechnology sc-418922 Dnase-free water provided for dilution
CryoStat Leica CM1950
Dissection Microscope Leica M125 C Used for post-necroscopy imaging
Dissolvable Sutures Med Vet International J385H
Distilled Water Gibco 15230162
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Thermo fisher Scientific 14190144 (-) Calcium; (-) Magnesium
ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) BTX Harvard Apparatus 45-0662 Generator only
Electric Razor Wahl CL9990 Kent Scientific
Electroporation paddles/Tweezertrodes BTX Harvard Apparatus 45-0487 3 mm diameter paddles; wires included
Embedding Cassette: 250 PK Grainger 21RK94 Placenta embedding cassettes
Ethanol Thermo Fisher Scientific 268280010
F-Air Canisters Penn Veterinary Supply Inc BIC80120 Excess isoflurane filter
Fast Green Dye FCF Sigma F7252-5G Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light
Filter-based microplate photometer (plate reader) Fisher Scientific 14377576 Can be used for BCA and ELISA
Forceps VWR 82027-386 Fine tips, straight, serrated
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma Aldrich HT501128
Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette) Sutter Instrument B150-86-10 O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length
Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) Thermo Scientific 1861281 Protein homogenization buffer
Heating Pad Thermotech S766D Digitial Moist Heating Pad
Hemostats VWR 10806-188 Fully surrated jaw; curved
Hot Water Bath Fisher Scientific 20253 Isotemp 205
Igf-1 SAM Plasmid (m1) Santa Cruz Biotechnology sc-421056-ACT Dnase-free water provided for dilution
Induction Chamber Vetamac 941443 No specific liter size required
Isoflurane Piramal Pharma Limited NDC 66794-013-25
Isoproponal/2-Proponal Fisher Scientific A451-4 RNA isolation
Ketamine HCl 100mg/ml Akorn NDC 59399-114-10
MgCl2/Magneisum Chloride Sigma Aldrich 63069-100ML 1M. Protein homogenization buffer
MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode Fisher Scientific 4309849 Barcoded plates not required
Microcapillary Tip Eppendorf 5196082001 Attached to BTX Microinjector
Microinjector BTX Harvard Apparatus 45-0766 Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes
Microject 1000A (Injection Machine) BTX Harvard Apparatus 45-0751 MicroJect 1000A Plus System
Micropipette Puller Model P-97 Sutter Instrument P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microplate Mixer (Plate Shaker) scilogex 822000049999
Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit R & D Systems MG100
Needles BD - Becton, Dickson, and Company 305106 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm)
Nitrogen Tank Linde 7727-37-9 Any innert gas
Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) Norbrook Laboratories Limited NDC 55529-040-10 Analesgic such as Meloxicam
Nose Cone Vetamac 921609 9-14 mm
Opal 620 detection dye Akoya Biosciences SKU FP1495001KT Used for FISH
Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound Sakura 4583
Oxygen Tank Linde 7782 - 44 - 7 Medical grade oxygen
Pestles USA Scientific Inc 14155390
Povidone-Iodine Solution, 5% Avrio Health L.P. NDC 67618-155-16
Power SYBR™ Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4367659 Use for qPCR
Random Hexamers (Random Primers) New England Biolabs S1330S Use for cDNA synthesis
Razor Blade Grainger 26X080
RNA Cleanup Kit & Concentrator Zymo Research R1013
RNALater Thermo Fisher Scientific AM7021
RNAscope kit v.2.5 Advanced Cells Diagnostics 323100 Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately.
RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 Advanced Cells Diagnostics  528641-C2
RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 Advanced Cells Diagnostics 527421
Roto-Therm Mini Benchmark R2020 Dry oven for in situ hybridization
Scissors VWR 82027-578 Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/?
Sodium Chloride (Saline) Hospra NDC 0409-4888-03 Sterile,  0.9%
Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] Research Product International 03-04-6132
Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical Fisher Scientific SS277 Protein homogenization buffer
Steamer Bella B00DPX8UBA
Sterile Surgical Drape Busse 696 Sterilize before use
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Surgipath Cover Glass 24x60 Leica 3800160
Syringes BD - Becton, Dickson, and Company 309659 BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL
Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer Fisher Scientific 13-400-525 This configuration comes with Qubit 4 fluorometer.  Qubit quantification not required.
Tissue Adhesive 3M 1469SB VetBond
Tris HCl Thermo Fisher Scientific 15568025 1M. Protein homogenization buffer
TRIzol™ Reagent Thermo Fisher Scientific 15596018 RNA isolation
TSA Buffer Pack Advanced Cells Diagnostics 322810 Used to dilute Opal 620 detection dye
Universal F-Circuit Vetamac 40200 Attached to vaporizer and vaporizer accessories
Upright Compound Fluorescence Microscope Olympus BX61VS Used for FISH imaging
Vectorshield with DAPI Vector Laboratories H-1200 Coverslip mounting media
ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block Thermo Fisher Scientific 4453536 This is for SYBR 384-well block detection.  TaqMan and/or smaller blocks available
Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color Amazon C450B
Xylazine 20mg/ml Anased 343730_RX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
  2. Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
  3. Rosenfeld, C. S. The placenta-brain-axis. Journal of Neuroscience Research. 99 (1), 271-283 (2021).
  4. Maslen, C. L. Recent advances in placenta-heart interactions. Frontiers in Physiology. 9, 735 (2018).
  5. Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230 (2021).
  6. Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570 (2018).
  7. Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
  8. vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
  9. Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756 (2022).
  10. Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
  11. Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
  12. Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236 (2012).
  13. Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
  14. Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
  15. Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652 (2017).
  16. Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
  17. Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44 (2017).
  18. Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632 (2013).
  19. Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
  20. Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
  21. Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T. Biosafety of adenoviral vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 527-543 (2003).
  22. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
  23. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  24. Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
  25. Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
  26. Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
  27. Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653 (2012).
  28. Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
  29. Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
  30. Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
  31. Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
  32. Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
  33. Nakamura, H. Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , Springer. Tokyo, Japan. (2009).
  34. Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909 (2020).
  35. Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
  36. Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202 (2012).
  37. Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
  38. Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
  39. Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118 (2021).
  40. Smajdor, A. Ethical challenges in fetal surgery. Journal of Medical Ethics. 37 (2), 88-91 (2011).
  41. Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).

Tags

Генетика выпуск 194 Плацента мышь CRISPR инсулиноподобный фактор роста 1 электропорация сверхэкспрессия развитие
Мышь <em>in vivo</em> Плацентарная манипуляция CRISPR
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carver, A. J., Taylor, R. J.,… More

Carver, A. J., Taylor, R. J., Stevens, H. E. Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation. J. Vis. Exp. (194), e64760, doi:10.3791/64760 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter