İnsan gözünde retinal pigment epitelini (RPE) retinadan etkin bir şekilde ayırmak ve RPE’nin histolojik ve morfometrik analizleri için tüm RPE / koroid düzlüklerini üretmek için bir yöntem tanımladık.
Retinal pigment epiteli (RPE) ve retina, ışık algısını ve görmeyi düzenlemek için birlikte çalışan fonksiyonel ve yapısal olarak bağlı dokulardır. RPE apikal yüzeyindeki proteinler, fotoreseptör dış segment yüzeyindeki proteinlerle sıkı bir şekilde ilişkilidir ve RPE’yi fotoreseptörlerden / retinadan tutarlı bir şekilde ayırmayı zorlaştırır. Fotoreseptörlerin ve RPE hücrelerinin ayrı hücresel analizi için tam RPE / koroid ve retina düz montajları üretmek üzere retinayı insan gözlerinin RPE’sinden verimli bir şekilde ayırmak için bir yöntem geliştirdik. RPE tarafından taşınmayan bir şeker olan yüksek ozmolariteli bir D-mannitol çözeltisinin intravitreal enjeksiyonu, RPE hücre bağlantılarına zarar vermeden RPE ve retinanın tüm arka oda boyunca ayrılmasını indükledi. Retinaya bağlı RPE yamaları gözlenmedi. Aktinin falloidin etiketlenmesi RPE şeklinin korunmasını gösterdi ve tüm epitelin morfometrik analizine izin verdi. RPE hücre sınırlarını doğru bir şekilde tanımak ve segmentlere ayırmak ve 30 farklı şekil metriğini ölçmek için yapay zeka (AI) tabanlı bir yazılım geliştirilmiştir. Bu diseksiyon yöntemi yüksek oranda tekrarlanabilir ve diğer hayvan modellerine kolayca genişletilebilir.
Retinal pigment epiteli (RPE) ve nöral retina, fotoreseptörlerin RPE’ye güçlü fizyolojik bağımlılığı nedeniyle birbirleriyle güçlü bir şekilde bağlantılıdır. Diseksiyon sırasında, nöral retinanın RPE’den mekanik olarak ayrılması, RPE hücrelerinin yırtılmasına neden olur, RPE’nin apikal kısımları retinal fotoreseptörlerin dış segmentlerine bağlı kalır. RPE-retinal adezyonun derecesi o kadar büyüktür ki, ayrılmadan sonra retinada kalan pigment miktarı, retinal adezyonun gücünü ölçmek için kullanılır1. Spesifik olarak, apikal tarafta bulunan RPE sıkı kavşaklar ve bunları birbirine bağlayan aktin yapısı, mekanik ayırma sırasında kopar. Bu nedenle, hücre kenarlıkları için RPE düz montajlarının boyanması, birçok hücrenin eksik kenarlıklara sahip olduğu yamalı bir tek katmanla sonuçlanır. Bu etki, doku diseksiyondan önce paraformaldehit (PFA) ile sabitlendiğinde, proteinler çapraz bağlandıkça daha da şiddetlenir.
İntravitreal ilaç dağıtımı üzerine yapılan çalışmalar, arka kamaraya hiperozmotik solüsyon enjeksiyonlarının retina dekolmanı indüklediğini göstermiştir 2,3. Bu deneylerde, orta vitreusa enjekte edilen 1.000 mOsm ila 2.400 mOsm arasında değişen 50 μL’lik farklı çözeltiler, dakikalar içinde retina dekolmanına neden oldu. Özellikle, yüksek ozmolariteli çözeltilere uzun süre maruz kaldıktan sonra bile, RPE sıkı bağlantıları, hem tavşan hem de maymun gözlerinin iletim elektron mikroskobik görüntülerinde bozulmadan ortaya çıktı3. Benzer bir stratejiyi takiben, RPE diseksiyonu yapmadan önce etkili bir retina dekolmanı indüklemek için orta vitreusa hiperozmotik bir D-mannitol çözeltisi enjekte ettik. D-mannitol RPE4 tarafından taşınmadığından, ozmotik bir gradyan oluşturarak yüksek bir intravitreal konsantrasyon korunur. RPE ve retinanın tüm arka kamara boyunca verimli bir şekilde ayrılması, RPE hücresel bağlantılarının korunmasını garanti eder ve tüm düz montajda RPE morfometrisinin incelenmesine izin verir. Buna ek olarak, floresan olarak etiketlenmiş RPE hücre sınırlarını tanıyan ve segmentlere ayıran, 30 farklı şekil metriğini ölçen ve görselleştirmeiçin her metriğin ısı haritalarını üreten yapay zeka (AI) tabanlı bir yazılım geliştirdik 5,6.
İnsan RPE ve retinalarının tutarlı ve verimli bir şekilde ayrılması bu protokol kullanılarak sağlanabilir. Bu yöntem, tüm insan retinalarında RPE şeklindeki bölgesel farklılıkların incelenmesine izin verir5. Protokoldeki önemli bir adım, RPE ve retinanın fiziksel olarak ayrılmasıdır. İki doku bazı bölgelerde tamamen ayrılmamışsa, retinayı hafifçe kaldırmalı ve dokuların kırılmamasını sağlamalıdır. Büyük düz montajların REShAPE analizi, önemli RAM kaynaklarına sahip sistemlerin kullanılmasını gerektirebilir. Bu durumda, tüm görüntünün yeniden montajı, yazılımın işlem kaynaklarının eksikliğine rağmen analizi başarıyla tamamlamasına izin vermek için devre dışı bırakılabilir.
İnsan RPE düz montajlarını segmentlere ayırmak için REShAPE kullanmanın ana sınırlaması, AI algoritmasının çoğunlukla indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı RPE görüntüleri üzerinde eğitilmiş olmasıdır. Sonuç olarak, insan RPE flatmount’larının segmentasyonu daha az doğrudur. Yaşlı donörlerden elde edilen RPE hücreleri çok miktarda lipofuscin7 içerir ve otofloresansının geniş spektrumu hücre sınır segmentasyonuna müdahale eder. Gelecekte, bu tür bir örnekte hücre sınırı segmentasyonunu iyileştirmek için RPE düz montajlarının daha fazla görüntüsü kullanılacaktır. Bu sınırlamaya rağmen, REShAPE, RPE hücre sınırlarını tanımak ve segmentlere ayırmak için özel olarak eğitilmiştir ve RPE hücrelerinin Voronoi8 ve CellProfiler9 segmentasyonu gibi diğer mevcut yöntemlerden daha iyi performans gösterir.
Ayrıca, manuel segmentasyon 10 ile karşılaştırıldığında, REShAPE büyük görüntüleri hızlı bir şekilde analiz etme avantajı sağlar (~ 130.000 piksel x130.000 piksel test edilmiştir). Sonuç olarak, bu diseksiyon yöntemi yüksek oranda tekrarlanabilir ve diğer hayvan modellerine kolayca genişletilebilir. Ek olarak, yazılım, belirli tedavilerin etkisini incelemek için göz düzlüklerinde veya hücre kültürü modellerinde RPE şeklini incelemek için kullanılabilir. Son olarak, REShAPE’nin çok yönlülüğü, diğer epitel hücrelerinin analizi için geniş çapta uygulanabilir olmasını sağlar.
The authors have nothing to disclose.
Zeiss Axio Scan.Z1’i kullandıkları için Ulusal Göz Enstitüsü (NEI) histoloji çekirdeğine teşekkür ederiz. Ayrıca bağışçılara, ailelerine, İlerleyen Görme Ağı’na ve Lions Göz Enstitüsü’ne cömertlikleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma NEI IRP fonları tarafından desteklenmiştir (hibe numarası ZIA EY000533-04).
Biopsy punch 1.5 mm | Acuderm Inc. | P1525 | |
Bovine albumin | MP Biomedicals | 160069 | |
Coverglass 50 x 75 mm, #1.5 thickness | Brain Research Laboratories | 5075-1.5D | |
Curved spatula | Katena | K3-6600 | |
D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
DPBS 1x with Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 14040-133 | |
Fine Scissors | Fine Science Tools | 14558-11 | |
Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
Forceps – Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
Microscope slides 50 x 75 x 1.2 mm | Brain Research Laboratories | 5075 | |
Needles 21 G x 1-1/2" hypodermic | Becton Dickinson (BD) | 305167 | |
Needles 27 G x 1-1/4" hypodermic | Becton Dickinson (BD) | 305136 | |
Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Petri dish 100 mm | Corning | 430167 | |
Phalloidin-iFluor 647 | Abcam | ab176759 | |
Razor blades | PAL (Personna) | 62-0177 | |
Round bottom tubes 50 mL | Newegg | 9SIA4SR9M88854 | |
Silicon Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 4019862 | |
Square weighing boat (81 mm x 81 mm x 25 mm) | Sigma | W2876 | |
Surgical Vitrectomy System | BD Visitrec | 585100 | optional |
Syringe 1 mL | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
TrueBlack | Biotium | 23007 | autofluorescence quencher |
Tween 20 | Affymetrix | 20605 | |
Vannas Spring Scissors – 3 mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-10 |