Denne protokollen illustrerer bruken av kommersielt tilgjengelige komponenter for å generere en stabil og lineær termisk gradient. Slik gradient kan da brukes til å bestemme den øvre termiske grensen for planktoniske organismer, spesielt virvelløse larver.
Termiske grenser og bredde har blitt mye brukt til å forutsi artsfordeling. Etter hvert som den globale temperaturen fortsetter å stige, er det viktig å forstå hvordan termisk grense endres med akklimatisering og hvordan den varierer mellom livsstadier og populasjoner for å bestemme artens sårbarhet for fremtidig oppvarming. De fleste marine organismer har komplekse livssykluser som inkluderer tidlige planktoniske stadier. Mens kvantifisering av den termiske grensen for disse små tidlige utviklingsstadiene (titalls til hundrevis av mikron) bidrar til å identifisere utviklingsflaskehalser, kan denne prosessen være utfordrende på grunn av den lille størrelsen på målorganismer, stort benkplassbehov og høye innledende fabrikasjonskostnader. Her presenteres et oppsett som er rettet mot små volumer (ml til titalls ml). Dette oppsettet kombinerer kommersielt tilgjengelige komponenter for å generere en stabil og lineær termisk gradient. Produksjonsspesifikasjoner for oppsettet, samt prosedyrer for å introdusere og oppregne levende versus døde individer og beregne dødelig temperatur, presenteres også.
Termisk toleranse er nøkkelen til organismers overlevelse og funksjon 1,2. Etter hvert som planeten fortsetter å varme på grunn av menneskeskapte karbonutslipp, blir det lagt økende vekt på bestemmelse og anvendelse av termiskegrenser. Ulike endepunkter, som dødelighet, manglende utvikling og tap av mobilitet, har blitt brukt til å bestemme både øvre og nedre termiske grenser4. Disse termiske grensene betraktes ofte som en proxy for en organismes termiske nisje. Denne informasjonen brukes igjen til å identifisere arter som er mer sårbare for global oppvarming, samt forutsi fremtidig artsfordeling og de resulterende artsinteraksjonene 3,5,6,7. Imidlertid kan bestemmelse av termiske grenser, spesielt for små planktoniske organismer, være utfordrende.
For planktoniske organismer, spesielt larvestadiene til marine virvelløse dyr, kan den termiske grensen bestemmes ved kronisk eksponering. Kronisk eksponering oppnås ved å oppdrette larver ved flere temperaturer over dager til uker og bestemme temperaturen der larveoverlevelse og / eller utviklingshastighet reduserer 8,9,10. Denne tilnærmingen er imidlertid ganske tidkrevende og krever store inkubatorer og erfaring med larvehold (se referanse11 for en god innføring i dyrking av marine virvelløse larver).
Alternativt kan akutt eksponering for termisk stress brukes til å bestemme termiske grenser. Ofte innebærer denne bestemmelsesmetoden å plassere små hetteglass med larver i temperaturkontrollerte tørre bad 12,13,14, utnytte termiske gradientfunksjoner i PCR termiske syklister 15,16, eller sette glassflasker / mikrosentrifugerør langs en termisk gradient generert ved påført oppvarming og kjøling på endene av store aluminiumsblokker med hull der hetteglassene passer godt 17, 18,19. Typiske tørre bad genererer en enkelt temperatur; Derfor må flere enheter betjenes samtidig for å vurdere ytelsen over en rekke temperaturer. Termiske syklister genererer en gradient, men har bare plass til et lite prøvevolum (120 μL) og krever forsiktige manipulasjoner. I likhet med termiske syklister skaper store aluminiumsblokker lineære og stabile temperaturgradienter. Begge tilnærmingene kan kombineres med logistisk eller probit regresjon for å beregne den dødelige temperaturen for 50% prosent av befolkningen (LT50) 12,20,21. Aluminiumsblokkene som ble brukt var imidlertid ~ 100 cm lange; Denne størrelsen krever en stor laboratorieplass og tilgang til spesialiserte datamaskin numeriske kontroll fresemaskiner for å bore hullene. Sammen med å bruke to vannbad av forskningskvalitet for å opprettholde måltemperaturen, er de økonomiske kostnadene ved å montere oppsettet høye.
Derfor tar dette arbeidet sikte på å utvikle en alternativ måte å generere en stabil, lineær temperaturgradient med kommersielt tilgjengelige deler. Et slikt produkt må ha et lite fotavtrykk og skal lett kunne brukes til akutte termiske stresseksponeringseksperimenter for planktoniske organismer. Denne protokollen er utviklet med dyreplankton som er <1 mm i størrelse som målorganismer, og dermed ble den optimalisert for bruk av et 1,5 eller 2 ml mikrosentrifugerør. Større studieorganismer vil kreve beholdere større enn de 1,5 ml mikrosentrifugerørene som brukes og forstørrede hull i aluminiumblokkene.
I tillegg til å gjøre forsøksapparatet mer tilgjengelig, har dette arbeidet som mål å forenkle databehandlingspipelinen. Mens kommersiell statistisk programvare gir rutiner for å beregne LT50 ved hjelp av logistisk eller probit regresjon, er lisenskostnaden ikke triviell. Derfor vil et brukervennlig skript som er avhengig av det statistiske programmet R22 med åpen kildekode gjøre dataanalyse mer tilgjengelig.
Denne protokollen viser hvordan en kompakt varmeblokk kan fremstilles med kommersielt tilgjengelige deler og brukes til å utsette dyreplankton (larver av sanddollaren Dendraster excentricus) for akutt varmestress for å bestemme deres øvre termiske grense.
Denne protokollen gir en tilgjengelig og tilpassbar tilnærming for å bestemme de termiske grensene for små planktonorganismer gjennom akutt termisk eksponering. 10-hulls design og fleksible temperaturendepunkter, styrt av vannbadet i den nedre enden og varmeren i den øvre enden, gjør det mulig å bestemme LT50 med presisjon. Ved hjelp av denne tilnærmingen kunne det påvises en forskjell i den termiske grensen som er <1 °C (figur 3). Denne tilnærmingen gir en rask bestemme…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet støttes av fakultetets forskningsfond ved Swarthmore College [KC] og Robert Reynolds og Lucinda Lewis ’70 Summer Research Fellowship for BJ.
0.45 µm membrane filter | VWR | 74300-042 | |
½” Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K266 | Used to construct a ridged case with sufficient insulation. |
1 mL syringe | VWR | 76290-420 | |
2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger | Omega Engineering | HH506A | Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube |
Automatic pipette | Ranin | ||
Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W |
McMaster-Carr | 3619K32 | |
Crystal Sea Bioassay Mix | Pentair | CM2B | Use to make aritifical seawater |
Denraster excentricus | M-Rep | Sand dollars from California | |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | |
DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm) | Amazon | Connects to water bath and used to cool one end of the block. | |
Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8" | McMaster-Carr | 86825K953 | Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes. |
Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation | McMaster-Carr | 4530K121 | Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature |
EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller | Amazon | Can be used in place of the lab-grade water bath | |
Example with larval sand dollar | |||
GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling | Amazon | Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements. | |
Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet) | Amazon | Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range | |
Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators | VWR | 89202-386 | Can be replaced with an aquarium chiller |
Microcentrifuge Tubes | VWR | 76019-014 | If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative |
Nitex mesh filter | Self made | Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing | |
Pasteur pipette | VWR | 14673-010 | |
Potassium Chloride (0.35 M) | Millpore-Sigma | P3911-500G | |
R statistical software. | The R Project for Statistical Computing | ||
Syringe needle | VWR | 89219-346 | Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used |
Tygon Tubing | McMaster-Carr | 5233K65 | Adjust to match the chiller and block used |
Zoo Med Repti Temp Rheostat | Chewy.com | Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output |