Metoder til undersøgelse af livmoderbidrag til graviditetsetablering i en ovariektomiseret musemodel

Summary

Graviditetsetablering er en dynamisk proces, der involverer kompleks embryo- og livmoderkrydstale. De præcise bidrag fra moderens livmodermiljø til disse processer forbliver et aktivt undersøgelsesområde. Her leveres detaljerede protokoller for at hjælpe med at designe in vivo dyremodeller til at løse disse forskningsspørgsmål.

Abstract

For at graviditet kan etableres, skal en levedygtig blastocyst med succes interagere med en modtagelig livmoderforing (endometrium) for at lette implantation og placenta dannelse og muliggøre igangværende graviditet. Begrænsningerne for graviditetssucces forårsaget af embryonale defekter er velkendte og er stort set blevet overvundet i de seneste årtier med stigningen i in vitro-befrugtning (IVF) og assisteret reproduktionsteknologi. Indtil videre har feltet imidlertid ikke overvundet begrænsningerne forårsaget af et utilstrækkeligt modtageligt endometrium, hvilket resulterer i stagnerende IVF-succesrater. Ovarie- og endometriefunktioner er tæt sammenflettet, da hormoner produceret af æggestokken er ansvarlige for endometriums menstruationscyklus. Som sådan, når du bruger gnavermodeller af graviditet, kan det være svært at fastslå, om et observeret resultat skyldes en ovarie eller livmoderunderskud. For at overvinde dette blev der udviklet en ovariectomized musemodel med embryooverførsel eller kunstig decidualisering for at muliggøre undersøgelse af livmoderspecifikke bidrag til graviditet. Denne artikel vil give instruktioner om, hvordan man udfører ovariektomi og give indsigt i forskellige teknikker til levering af eksogene hormoner til støtte for vellykket kunstig decidualisering eller graviditet efter embryooverførsel fra raske donorer. Disse teknikker omfatter subkutan injektion, pellets med langsom frigivelse og osmotiske minipumper. De vigtigste fordele og ulemper ved hver metode vil blive diskuteret, så forskere kan vælge det bedste undersøgelsesdesign til deres specifikke forskningsspørgsmål.

Introduction

Med den stigende brug af assisteret reproduktionsteknologi i de seneste årtier er mange barrierer for undfangelse blevet overvundet, hvilket gør det muligt for mange par at starte familier på trods af fertilitetsproblemer¹. Oocyt- eller sædunderskud kan ofte omgås ved hjælp af in vitro-befrugtning eller intracytoplasmatisk sædinjektion; Imidlertid forbliver problemer relateret til livmoderen og endometriemodtagelighed en undvigende “sort boks” af reproduktionspotentiale².

Graviditet etableres, når et embryo af høj kvalitet med succes interagerer med et modtageligt endometrium (livmoderforing). Chancerne for vellykket graviditet i en given menstruationscyklus er lave, omkring 30%^3,4. Af dem, der er vellykkede, går kun 50% -60% forbi 20 ugers svangerskab, hvor implantationssvigt er ansvarlig for 75% af graviditeter, der ikke når 20 uger³. På trods af disse tal, der går tilbage til slutningen af 1990’erne, er feltet endnu ikke overvundet begrænsningerne forårsaget af et utilstrækkeligt modtageligt endometrium. Dette har resulteret i stagnerende – og undertiden faldende – IVF-succesrater i de senere år ^5,6.

Kvinder med uforklarlig infertilitet har ofte et forskudt vindue af modtagelighed eller er ude af stand til at opnå modtagelighed af ukendte årsager. For nylig blev endometriemodtagelighedsarrayet udviklet, som vurderer ekspressionen af hundredvis af gener med det formål at skræddersy tidspunktet for embryooverførsel til en persons vindue af modtagelighed ^7,8,9. Imidlertid mangler feltet stadig en forståelse af patogenesen af graviditetskomplikationer, der manifesterer sig efter implantationsprocessen er afsluttet.

Det kvindelige reproduktive system er meget dynamisk og under stram hormonel kontrol. Hypothalamus-hypofyse-gonadal (HPG) akse styrer frigivelsen af luteiniserende hormon og follikelstimulerende hormon, som regulerer aspekter af æggestokkens cyklus, herunder follikelmodning og østrogen- og progesteronaktivitet. Til gengæld reguleres livmoderens menstruationscyklus af østrogener og progesteron^10,11. Således er undersøgelse af livmoderbiologiske mekanismer kompliceret af ovarieindflydelse. For eksempel, når man studerer, hvordan kræftbehandlinger kan påvirke livmoderen, kan det være svært at skelne, om nogen observeret livmoderfænotype (såsom graviditetstab eller menstruationsacyklicitet) er resultatet af en direkte fornærmelse mod livmoderen eller en følgevirkning fra skade på æggestokkene.

For omfattende forståelse af fertiliteten skal livmoderbidragene til graviditet karakteriseres. Det er vigtigt, at denne forståelse skal strække sig ud over livmoderfunktionen under ovariekontrol. Dette kan ikke undersøges hos mennesker; Derfor anvendes dyremodeller ofte. Som sådan er ovariektomi (OVX) almindeligt anvendt til at gøre det muligt for forskere at regulere gnaveres østruscyklusser (analogt med menstruationscyklussen) ved at levere hormoner eksogent. Derudover tillader OVX, at livmoderresponser undersøges uafhængigt af ovariepåvirkning¹². Men hvis hormoner ikke straks leveres efter OVX, vil der opstå en overgangsalderfænotype, som skal overvejes nøje af forskerne.

OVX bruges ofte i gnavermodeller 13,14,15,16,17 og er relativt let at udføre efter tilstrækkelig træning. Metoderne varierer afhængigt af, om æggestokken alene eller æggestokken og ovidukten fjernes, samt afhængigt af dyrets alder (voksne, cyklende dyr har større æggestokke med et synligt corpus luteum på deres overflade, hvilket betyder, at deres æggestokke er lettere at visualisere). Tilsvarende, mange metoder til hormontilskud eksisterer, herunder subkutane injektioner¹⁴, langsom frigivelse pellets¹⁵, osmotiske mini pumper¹⁸, og ovarie podning.

I denne artikel gives detaljerede instruktioner om, hvordan man udfører ovariektomi og forbereder tre typer hormontilskud, herunder subkutane injektioner, pellets med langsom frigivelse og osmotiske minipumper. Der findes to detaljerede protokoller for eksperimentelle endepunkter, der drager fordel af OVX efterfulgt af eksogent hormontilskud (embryooverførsel og kunstig decidualisering). Denne artikel diskuterer styrker og svagheder ved hver tilgang med det formål at vejlede forskere om, hvordan man udfører undersøgelser for at isolere virkningerne på livmoderen, specifikt inden for graviditets- og fertilitetsforskningsområderne.

Protocol

Alle dyr blev anbragt i temperaturstyrede faciliteter med høje barrierer (Monash University Animal Research Laboratory) med gratis adgang til mad og vand og en 12 timers lys-mørk cyklus. Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med godkendelse fra Monash Animal Research Platform Ethics Committee (#21908, 17971) og udført i overensstemmelse med National Health and Medical Research Council Code of Practice for pleje og brug af dyr. 1. Kirurgisk forberedelse A…

Representative Results

En velkarakteriseret model for kunstig decidualisering er beskrevet i dette protokolpapir (figur 1A). Her gennemgik unge voksne hunmus (8 uger gamle) kirurgisk ovariektomi som beskrevet i afsnit 1 og 2. Musene blev derefter hvilet i 2 uger for at sikre, at de endogene ovariehormoner forsvandt, før de blev understøttet med eksogene hormoner som beskrevet i afsnit 3-7 og afsnit 9. Kunstig decidualisering blev induceret ved en intravaginal injektion af sesamolie, og dere…

Discussion

Denne artikel indeholder trinvise instruktioner om, hvordan man udfører OVX og giver eksogene hormoner til undersøgelser med fokus på at forstå livmoderbidragene til graviditet og fertilitet. Der gives to detaljerede protokoller om to eksperimentelle anvendelser af disse metoder, herunder udførelse af embryooverførsel og kunstig decidualisering.

Mens udførelse af OVX kan være udfordrende i starten – især for forskere, der er nye til gnavermodeller – er det en relativt enkel procedure,…

Materials

ALZET 1002 mini osmotic pumps	BioScientifica	1002	Delivers 0.25 µL/h for 14 days. Use for section 7 (Experimental procedure – Embryo transfer).
ALZET 1003D mini osmotic pumps	BioScientifica	1003D	Delivers 1 µL/h for 14 days. Use for section 8 (Experimental procedure – Artificial decidualization).
ALZET Reflex 7 mm clips	BioScientifica	0009971	Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
ALZET Reflex clip applicator	BioScientifica	0009974	Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
ALZET Reflex clip remover	BioScientifica	0009976	Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
Bupivicaine injection	Pfizer	NA	Stock 0.5%. Use at 0.05% in saline
Estradiol	Sigma	E8875
Meloxicam	Ilium	NA	Active constituent 0.5 mg/mL. Use 3.5 mL per 200 mL cage bottle, or as your institutions vet prescribes.
Michel clips	Daniels	NS-000242
Multi purpose sealant	Dow Corning	732
Non-surgical embryo transfer (NSET) device	ParaTechs	60010	Contains 6 mm speculum. Single use only.
Progesterone	Sigma	P0130	Soluble in ethanol. Use for  section 3 (Hormone preparation – subcutaneous injection) and  section 4 (Hormone preparation – slow-release pellets)
Progesterone	Sigma	P7556	Soluble in water. Use for section 5 (Hormone preparation – osmotic mini pumps)
Refresh eye ointment	Allergan	NA	42.5% w/v liquid paraffin, 57.3% w/v soft white paraffin
Rimadyl Carprofen	Zoetis	NA	Stock 50 mg/mL. Use at 5 mg/kg
Rubber tubing	Dow Corning	508-008	Washed in 100% ethanol and cut into 1 cm pieces. Inside diameter 1.57 mm ±  0.23 mm; outside diamater 3.18 mm ± 0.23 mm; wall 0.81 mm.
Sesame oil	Sigma	S3547
Sofsilk Silk sutures size 3-0	Covidien	GS-832