चूहे के पृष्ठीय जड़ नाड़ीग्रन्थि खोजों और श्वान कोशिकाओं के सह-संवर्धन में परिधीय अक्षतंतु का इन विट्रो माइलिनेशन
Summary
पृष्ठीय जड़ गैन्ग्लिया और श्वान कोशिकाओं की कोकल्चर प्रणाली में, परिधीय तंत्रिका तंत्र के माइलिनेशन का अध्ययन किया जा सकता है। यह मॉडल परिधीय माइलिनेशन का निरीक्षण और मात्रा निर्धारित करने और माइलिन म्यान पर रुचि के यौगिकों के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए प्रयोगात्मक अवसर प्रदान करता है।
Abstract
तंत्रिका तंत्र में तेजी से और पर्याप्त सिग्नल ट्रांसडक्शन को सक्षम करने के लिए माइलिनेशन की प्रक्रिया आवश्यक है। परिधीय तंत्रिका तंत्र में, न्यूरॉन्स और श्वान कोशिकाएं अक्षतंतु के माइलिनेशन को नियंत्रित करने के लिए एक जटिल बातचीत में संलग्न होती हैं। इस बातचीत की गड़बड़ी और माइलिन म्यान का टूटना भड़काऊ न्यूरोपैथियों की पहचान है और न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों में द्वितीयक रूप से होता है। यहां, हम पृष्ठीय जड़ नाड़ीग्रन्थि खोजों और श्वान कोशिकाओं का एक सह-संस्कृति मॉडल प्रस्तुत करते हैं, जो परिधीय तंत्रिका तंत्र में माइलिनेशन की प्रक्रिया की जांच करने, अक्षतंतु-श्वान सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने और प्रत्येक सेल प्रकार पर चिकित्सीय एजेंटों के संभावित प्रभावों का अलग से मूल्यांकन करने के लिए परिधीय अक्षतंतु का एक मजबूत माइलिनेशन विकसित करता है। पद्धतिगत रूप से, भ्रूण चूहों (ई 13.5) के पृष्ठीय जड़ नाड़ीग्रन्थि को काटा गया, उनके आसपास के ऊतक से अलग किया गया, और 3 दिनों के लिए पूरे खोज के रूप में सुसंस्कृत किया गया। श्वान कोशिकाओं को 3 सप्ताह के वयस्क चूहों से अलग किया गया था, और साइटिक नसों को एंजाइमेटिक रूप से पचाया गया था। परिणामस्वरूप श्वान कोशिकाओं को चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग द्वारा शुद्ध किया गया और न्यूरेगुलिन और फोर्सकोलिन-समृद्ध स्थितियों के तहत सुसंस्कृत किया गया। पृष्ठीय जड़ नाड़ीग्रन्थि खोज संस्कृति के 3 दिनों के बाद, 30,000 श्वान कोशिकाओं को एस्कॉर्बिक एसिड युक्त माध्यम में एक पृष्ठीय जड़ नाड़ीग्रन्थि खोज में जोड़ा गया था। माइलिनेशन के पहले संकेतों का पता कोकल्चर के 10 वें दिन लगाया गया था, इम्यूनोसाइटोकेमिकल धुंधला होने में माइलिन बेसिक प्रोटीन के लिए बिखरे हुए संकेतों के माध्यम से। 14 वें दिन से, माइलिन म्यान का गठन किया गया और अक्षतंतु के साथ प्रचारित किया गया। माइलिनेशन को माइलिनेशन क्षेत्र और अक्षतंतु क्षेत्र के अनुपात के रूप में माइलिन मूल प्रोटीन धुंधला करके परिमाणित किया जा सकता है, जो अक्षीय घनत्व में अंतर के लिए जिम्मेदार है। यह मॉडल विट्रो में परिधीय माइलिनेशन के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए प्रयोगात्मक अवसर प्रदान करता है, जो परिधीय तंत्रिका तंत्र के भड़काऊ और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में डिमाइलिनेशन और न्यूरोडीजेनेरेशन के लिए पैथोलॉजी और संभावित उपचार के अवसरों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है।
Introduction
परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएनएस) में, तेजी से सूचना पारगमन माइलिन-संलग्न अक्षतंतु द्वारा मध्यस्थ होता है। विद्युत आवेगों के तेजी से प्रसार को सक्षम करने के लिए अक्षतंतु का माइलिनेशन आवश्यक है, क्योंकि तंत्रिका तंतुओं का चालन वेग अक्षतंतु व्यास और माइलिन मोटाई1 से संबंधित है। परिधि से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) तक संवेदी संकेतन प्रथम-क्रम संवेदी न्यूरॉन्स के सक्रियण पर निर्भर करता है जो पृष्ठीय जड़ के विस्तार में रहते हैं, जिसे पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया (डीआरजी) कहा जाता है। माइलिन के गठन और रखरखाव के लिए, अक्षतंतु और श्वान कोशिकाओं के बीच निरंतर संचार, जो पीएनएस में माइलिनेटेड ग्लिया कोशिकाएं हैं, अनिवार्यहै2.
पीएनएस के कई रोग प्राथमिक अक्षीय या डिमाइलेटिंग क्षति द्वारा सूचना के पारगमन को परेशान करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप हाइपेस्थेसिया या डिस्थेसिया होता है। न्यूरॉन और आसपास के श्वान कोशिकाओं के बीच एक जटिल बातचीत द्वारा, न्यूरोनल क्षति के बाद प्रथम-क्रम संवेदी न्यूरॉन्स में एक हद तक पुनर्जीवित करने की क्षमता होतीहै। इस मामले में, श्वान कोशिकाएं अक्षीय के साथ-साथ माइलिन मलबे को साफ करने और अक्षीय पुनर्जनन को बढ़ावा देने के लिए सेलुलर रीप्रोग्रामिंग से गुजर सकती हैं, जिसके परिणामस्वरूप रिमाइलिनेशन4 होता है। स्वास्थ्य और बीमारी में माइलिनेशन के तंत्र को समझना महत्वपूर्ण है, ताकि पीएनएस के विकारों को कम करने के लिए संभावित उपचार विकल्पों को खोजा जा सके। माइलिन को तीव्र न्यूरोट्रॉमा से भी नुकसान हो सकता है, और परिधीय तंत्रिका चोट के बाद कार्यात्मक वसूली को आगे बढ़ाने के लिए माइलिनेशन को बढ़ावा देने केदृष्टिकोण जांच के अधीन हैं।
परिधीय माइलिनेशन के हमारे ज्ञान को श्वान कोशिकाओं और संवेदी न्यूरॉन्स के माइलिनेटेड कोकल्चर से काफी हद तक लाभ हुआ है। चूंकि पहले दृष्टिकोण 6,7,8 लागू किए गए थे, इसलिए माइलिनेशन का विभिन्न कोकल्चर सिस्टम 9,10,11 के उपयोग के साथ तीव्रता से अध्ययन किया गया है। यहां, हम पृष्ठीय जड़ नाड़ीग्रन्थि अक्षतंतु के मजबूत इन विट्रो माइलिनेशन के लिए एक तेज़ और आसान प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। श्वान सेल तैयारी के लिए प्रोटोकॉल एंडरसन एट अल.12 द्वारा प्रोटोकॉल पर आधारित है, जिसे पहले पिटारोकोइली एट अल.13 में प्रकाशित किया गया था। हम कोकल्चर के लिए किशोर चूहों और भ्रूण डीआरजी खोज संस्कृतियों से प्राप्त श्वान कोशिकाओं का उपयोग करते हैं, जिसमें माइलिनेशन लगभग 14 वें दिन होता है। विधि का लक्ष्य प्रत्यक्ष एक्सोन-श्वान सेल इंटरैक्शन के परिणामस्वरूप माइलिन के गठन की जांच करने और पीएनएस माइलिनेशन के मॉड्यूलेटर का अध्ययन करने के लिए एक प्रणाली प्रदान करना है। विघटित न्यूरोनल सेल संस्कृतियों की तुलना में, डीआरजी खोज अधिक शारीरिक रूप से संरक्षित होते हैं और लंबी अक्षीय प्रक्रियाओं का निर्माण करते हैं। माइलिनेटेड अक्षतंतु क्षेत्र का परिमाणीकरण कोकल्चर में माइलिनेशन के लिए पर्याप्त रीडआउट प्रदान करता है। विधि पीएनएस माइलिनेशन पर उनके संभावित प्रभाव के लिए चिकित्सीय यौगिकों को स्क्रीन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है, और इसका उपयोग पशु मॉडल14 में विवो अध्ययन के अलावा भी किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम दो अलग-अलग सेल प्रकार संस्कृतियों, श्वान कोशिकाओं और पृष्ठीय जड़ नाड़ीग्रन्थि खोजों को विलय करके इन विट्रो माइलिनेशन की पीढ़ी के लिए एक तेज़ और आसान प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम प्रोफेसर डॉ राल्फ गोल्ड और पीडी डॉ गिसा एलरिचमैन को उनकी सलाह और समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Anti-MBP, rabbit | Novus Biologicals, Centannial, USA | ABIN446360 | |
| Anti-ßIII-tubulin, mouse | Biolegend, San Diego, USA | 657402 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | A4403-100MG | |
| B27-supplement | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 17504-044 | |
| Biosphere Filter Tip, 100 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70760212 | |
| Biosphere Filter Tip, 1250 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701186210 | |
| Biosphere Filter Tip, 20 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701114210 | |
| Biosphere Filter Tip, 300 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70765210 | |
| Bovine serum albumin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8076.4 | |
| Cell strainer, 100 µM | BD Bioscience, Heidelberg, Germany | 352360 | |
| Centrifuge 5810-R | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5811000015 | |
| CO2 Incubator Heracell | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Coverslips 12 mm | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P231.1 | |
| Curved fine forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-42 | |
| DAPI fluoromount-G(R) | Biozol, Eching, Germany | SBA-0100-20 | |
| Dispase II | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | 4942078001 | |
| Distilled water (Water Purification System) | Millipore, Molsheim, France | ZLXS5010Y | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 31331093 | |
| DPBS (no Ca2+ and no Mg2+) | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D8537-6X500ML | |
| Ethanol | VWR, Radnor, USA | 1009862500 | |
| FCS | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F7524 | FCS must be tested for Schwann cell culture |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11252-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-40 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F6886-10MG | |
| Gelatin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | G1393-20ML | |
| Gentamycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 5710064 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11036 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11001 | |
| HBSS (no Ca2+ and no Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 14170138 | |
| HERAcell Incubator | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Heraguard ECO 1.2 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51029882 | |
| Horse serum | Pan-Biotech, Aidenbach, Germany | P30-0712 | |
| Image J Software | HIH, Bethesda, USA | ||
| Laminin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | L2020-1MG | |
| Leibovitz´s L-15 Medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 11415064 | |
| L-Glutamine 200 mM | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25030024 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130042303 | |
| Microscissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15000-08 | |
| Microscope | Motic, Wetzlar, Germany | Motic BA 400 | |
| Microscope Axio observer 7 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 491917-0001-000 | |
| Microscope slide | VWR, Radnor, USA | 630-1985 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130091632 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-201 | |
| Neubauer counting chamber | Assistant, Erlangen, Germany | 40441 | |
| Neuregulin | Peprotech, Rocky Hill, USA | 100-03 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 21103049 | |
| NGF | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | N1408 | |
| Normal goat serum | Biozol, Eching, Germany | S-1000 | |
| Nunclon Δ multidishes, 4 well | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D6789 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics, New Jersey, USA | 10342243 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15140-122 | |
| Pipetboy | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 4430000018 | |
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 2231300004 | |
| Poly-D-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P6407-5MG | |
| Poly-L-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P4707-50ML | |
| Reaction tubes, 15 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62554502 | |
| Reaction tubes, 50 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62547254 | |
| Reaction vessels, 1.5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| Safety Cabinet S2020 1.8 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51026640 | |
| Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14083-08 | |
| Serological pipette, 10 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861254025 | |
| Serological pipette, 25 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861685001 | |
| Serological pipette, 5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861253001 | |
| Spatula | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 10094-13 | |
| Stereomicroscope Discovery.V8 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 495015-0012-000 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14007-14 | |
| TC dish 100, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833902300 | |
| TC dish 35, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833900300 | |
| TC dish 60, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833901300 | |
| Thy-1 Microbeads (MACS Kit) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-094-523 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | X100-500ML | |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25300-054 | |
| Type I Collagenase | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | C1639 | |
| Water bath type 1008 | GFL, Burgwedel, Germany | 4285 |
Riferimenti
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