ラット背根神経節外植片とシュワン細胞の共培養における末梢軸索のin vitro髄鞘形成
Summary
後根神経節とシュワン細胞の共培養系では、末梢神経系の髄鞘形成を研究することができます。このモデルは、末梢髄鞘形成を観察および定量化し、ミエリン鞘に対する目的の化合物の影響を研究するための実験的機会を提供します。
Abstract
髄鞘形成のプロセスは、神経系における迅速かつ十分なシグナル伝達を可能にするために不可欠です。末梢神経系では、ニューロンとシュワン細胞が複雑な相互作用を起こして軸索の髄鞘形成を制御します。この相互作用の乱れとミエリン鞘の破壊は炎症性神経障害の特徴であり、神経変性疾患で二次的に発生します。.ここでは、末梢神経系における髄鞘形成のプロセスを調査し、軸索-シュワン細胞相互作用を研究し、各細胞タイプに対する治療薬の潜在的な効果を評価するために、末梢軸索の堅牢な髄鞘形成を開発する後根神経節外植片とシュワン細胞の共培養モデルを紹介します。方法論的には、胚性ラット(E13.5)の背根神経節を採取し、それらの周囲組織から解離させ、3日間全外植片として培養した。3週齢の成体ラットからシュワン細胞を単離し、坐骨神経を酵素消化した。得られたシュワン細胞を磁気活性化セルソーティングにより精製し、ニューレグリンおよびフォルスコリン富化条件下で培養した。後根神経節外植片培養の3日後、アスコルビン酸を含む培地中で1つの後根神経節外植片に30,000シュワン細胞を添加した。髄鞘形成の最初の徴候は、共培養の10日目に、免疫細胞化学染色におけるミエリン塩基性タンパク質の散在シグナルを介して検出された。14日目以降、ミエリン鞘が形成され、軸索に沿って伝播した。髄鞘形成は、髄鞘形成面積と軸索面積の比としてミエリン塩基性タンパク質染色によって定量化することができ、軸索密度の違いを説明する。このモデルは、末梢神経系の炎症性および神経変性疾患における脱髄および神経変性の病理および可能な治療機会を理解するために不可欠な、 in vitroでの末梢髄鞘形成のさまざまな側面を研究する実験的機会を提供します。
Introduction
末梢神経系(PNS)では、急速な情報伝達はミエリンに包まれた軸索によって媒介されます。神経線維の伝導速度は軸索径とミエリンの厚さに相関するため、軸索の髄鞘形成は電気インパルスの高速伝播を可能にするために不可欠です1。末梢から中枢神経系(CNS)への感覚シグナル伝達は、後根神経節(DRG)と呼ばれる後根の拡大に存在する一次感覚ニューロンの活性化に依存しています。ミエリンの形成と維持のためには、軸索とPNSの有髄グリア細胞であるシュワン細胞との間の継続的なコミュニケーションが必須です2。
PNSの多くの疾患は、原発性軸索または脱髄損傷のいずれかによる情報の伝達を妨げ、知覚異常または感覚異常をもたらす。一次感覚ニューロンは、ニューロン損傷後、ニューロンと周囲のシュワン細胞との複雑な相互作用によってある程度再生する能力を有する3。この場合、シュワン細胞は細胞のリプログラミングを受けて軸索およびミエリンの破片を取り除き、軸索再生を促進し、髄鞘再形成をもたらすことができる4。PNSの脱髄障害の可能な治療選択肢を見つけるために、健康と病気における髄鞘形成のメカニズムを理解することは重要です。ミエリンは急性神経外傷によっても損傷を受ける可能性があり、末梢神経損傷後の機能回復を促進するために髄鞘形成を促進するアプローチが研究中です5。
末梢髄鞘形成に関する私たちの知識は、シュワン細胞と感覚ニューロンの有髄共培養から主に恩恵を受けています。最初のアプローチが適用されて以来6、7、8、髄鞘形成は、異なる共存系の使用により鋭意研究されてきた9、10、11。ここでは、後根神経節軸索の堅牢なin vitro髄鞘形成のための迅速かつ容易なプロトコルを提供します。シュワン細胞調製のためのプロトコルは、以前にPitarokoiliら13で発表されたAndersenらによるプロトコル12に基づいている。共培養には、幼若ラット由来のシュワン細胞と胚性DRG外植片培養物を使用し、14日目頃に髄鞘形成が起こります。この方法の目的は、直接軸索-シュワン細胞相互作用の結果としてのミエリンの形成を調査し、PNS髄鞘形成のモジュレーターを研究するシステムを提供することです。解離した神経細胞培養と比較して、DRG外植片はより解剖学的に保存され、長い軸索突起を形成します。有髄軸索領域の定量化は、共培養における髄鞘形成のための十分な読み出しを提供する。この方法は、PNS髄鞘形成に対する潜在的な効果について治療用化合物をスクリーニングするための貴重なツールであり、動物モデルでのin vivo研究に加えて利用することもできます14。
Protocol
すべての手順は、実験動物の世話と使用に関する欧州共同体理事会指令に従って実施されました。 1. シュワン細胞培養 シュワン細胞培養用コーティング細胞培養皿を無菌条件下でコーティングします。2 mLの0.01%ポリ-L-リジン(PLL)をそれぞれ2つの60 mm組織培養(TC)ディッシュに塗布し、4°Cで一晩インキュベートします。 PLLを取り出し、TC?…
Representative Results
共培養における髄鞘形成は、10、12、14、16、18、および20日目に評価されました。DRG外植片およびシュワン細胞をMBP、βIII-チューブリン、およびDAPIについて染色した。共存における軸索網は密集しており、観察の経時的には目に見えて変化しなかった。小さな断片の形のミエリンの最初の兆候は、10日目に検出され、12日目に増加しました(図2)。MBP陽性領域は、培養20日目…
Discussion
ここでは、2つの別々の細胞型培養物、シュワン細胞と後根神経節外植片をマージすることにより、 in vitro 髄鞘形成を生成するための迅速で簡単なプロトコルを提示します。
プロトコルの重要なステップは、特に培養の最初の数日間のDRG外植片の栽培です。DRGは、強力な軸索ネットワークが構築される前は非常に脆弱であり、インキュベーターから取り出したとき…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ラルフ・ゴールド教授とジサ・エルリッヒマン博士のアドバイスとサポートに感謝します。
Materials
| Anti-MBP, rabbit | Novus Biologicals, Centannial, USA | ABIN446360 | |
| Anti-ßIII-tubulin, mouse | Biolegend, San Diego, USA | 657402 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | A4403-100MG | |
| B27-supplement | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 17504-044 | |
| Biosphere Filter Tip, 100 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70760212 | |
| Biosphere Filter Tip, 1250 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701186210 | |
| Biosphere Filter Tip, 20 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701114210 | |
| Biosphere Filter Tip, 300 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70765210 | |
| Bovine serum albumin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8076.4 | |
| Cell strainer, 100 µM | BD Bioscience, Heidelberg, Germany | 352360 | |
| Centrifuge 5810-R | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5811000015 | |
| CO2 Incubator Heracell | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Coverslips 12 mm | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P231.1 | |
| Curved fine forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-42 | |
| DAPI fluoromount-G(R) | Biozol, Eching, Germany | SBA-0100-20 | |
| Dispase II | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | 4942078001 | |
| Distilled water (Water Purification System) | Millipore, Molsheim, France | ZLXS5010Y | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 31331093 | |
| DPBS (no Ca2+ and no Mg2+) | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D8537-6X500ML | |
| Ethanol | VWR, Radnor, USA | 1009862500 | |
| FCS | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F7524 | FCS must be tested for Schwann cell culture |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11252-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-40 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F6886-10MG | |
| Gelatin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | G1393-20ML | |
| Gentamycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 5710064 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11036 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11001 | |
| HBSS (no Ca2+ and no Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 14170138 | |
| HERAcell Incubator | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Heraguard ECO 1.2 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51029882 | |
| Horse serum | Pan-Biotech, Aidenbach, Germany | P30-0712 | |
| Image J Software | HIH, Bethesda, USA | ||
| Laminin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | L2020-1MG | |
| Leibovitz´s L-15 Medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 11415064 | |
| L-Glutamine 200 mM | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25030024 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130042303 | |
| Microscissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15000-08 | |
| Microscope | Motic, Wetzlar, Germany | Motic BA 400 | |
| Microscope Axio observer 7 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 491917-0001-000 | |
| Microscope slide | VWR, Radnor, USA | 630-1985 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130091632 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-201 | |
| Neubauer counting chamber | Assistant, Erlangen, Germany | 40441 | |
| Neuregulin | Peprotech, Rocky Hill, USA | 100-03 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 21103049 | |
| NGF | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | N1408 | |
| Normal goat serum | Biozol, Eching, Germany | S-1000 | |
| Nunclon Δ multidishes, 4 well | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D6789 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics, New Jersey, USA | 10342243 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15140-122 | |
| Pipetboy | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 4430000018 | |
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 2231300004 | |
| Poly-D-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P6407-5MG | |
| Poly-L-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P4707-50ML | |
| Reaction tubes, 15 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62554502 | |
| Reaction tubes, 50 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62547254 | |
| Reaction vessels, 1.5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| Safety Cabinet S2020 1.8 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51026640 | |
| Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14083-08 | |
| Serological pipette, 10 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861254025 | |
| Serological pipette, 25 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861685001 | |
| Serological pipette, 5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861253001 | |
| Spatula | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 10094-13 | |
| Stereomicroscope Discovery.V8 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 495015-0012-000 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14007-14 | |
| TC dish 100, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833902300 | |
| TC dish 35, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833900300 | |
| TC dish 60, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833901300 | |
| Thy-1 Microbeads (MACS Kit) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-094-523 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | X100-500ML | |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25300-054 | |
| Type I Collagenase | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | C1639 | |
| Water bath type 1008 | GFL, Burgwedel, Germany | 4285 |
Riferimenti
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Citazione di questo articolo
Blusch, A., Sgodzai, M., Rilke, N., Motte, J., König, J., Pitarokoili, K., Grüter, T. In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells. J. Vis. Exp. (192), e64768, doi:10.3791/64768 (2023).