Mielinización in vitro de axones periféricos en un cocultivo de explantes de ganglio de raíz dorsal de rata y células de Schwann

Summary

En el sistema de cocultivo de los ganglios de la raíz dorsal y las células de Schwann, se puede estudiar la mielinización del sistema nervioso periférico. Este modelo proporciona oportunidades experimentales para observar y cuantificar la mielinización periférica y estudiar los efectos de compuestos de interés en la vaina de mielina.

Abstract

El proceso de mielinización es esencial para permitir una transducción de señal rápida y suficiente en el sistema nervioso. En el sistema nervioso periférico, las neuronas y las células de Schwann participan en una interacción compleja para controlar la mielinización de los axones. Las alteraciones de esta interacción y la ruptura de la vaina de mielina son características de las neuropatías inflamatorias y ocurren secundariamente en trastornos neurodegenerativos. Aquí, presentamos un modelo de cocultivo de explantes de ganglio de raíz dorsal y células de Schwann, que desarrolla una mielinización robusta de axones periféricos para investigar el proceso de mielinización en el sistema nervioso periférico, estudiar las interacciones axón-célula de Schwann y evaluar los efectos potenciales de los agentes terapéuticos en cada tipo de célula por separado. Metodológicamente, los ganglios de la raíz dorsal de ratas embrionarias (E13.5) fueron cosechados, disociados de su tejido circundante y cultivados como explantes enteros durante 3 días. Las células de Schwann se aislaron de ratas adultas de 3 semanas de edad, y los nervios ciáticos se digirieron enzimáticamente. Las células de Schwann resultantes se purificaron mediante clasificación celular activada magnéticamente y se cultivaron en condiciones enriquecidas con neuregulina y forskolina. Después de 3 días de cultivo de explante del ganglio de la raíz dorsal, se agregaron 30,000 células de Schwann a un explante del ganglio de la raíz dorsal en un medio que contenía ácido ascórbico. Los primeros signos de mielinización se detectaron en el día 10 de cocultivo, a través de señales dispersas para la proteína básica de mielina en la tinción inmunocitoquímica. A partir del día 14, se formaron vainas de mielina y se propagaron a lo largo de los axones. La mielinización se puede cuantificar mediante tinción de proteínas básicas de mielina como una relación entre el área de mielinización y el área del axón, para tener en cuenta las diferencias en la densidad axonal. Este modelo proporciona oportunidades experimentales para estudiar diversos aspectos de la mielinización periférica in vitro, lo cual es crucial para comprender la patología y las posibles oportunidades de tratamiento para la desmielinización y la neurodegeneración en enfermedades inflamatorias y neurodegenerativas del sistema nervioso periférico.

Introduction

En el sistema nervioso periférico (SNP), la transducción rápida de información está mediada por axones envueltos en mielina. La mielinización de los axones es esencial para permitir la rápida propagación de los impulsos eléctricos, ya que la velocidad de conducción de las fibras nerviosas se correlaciona con el diámetro del axón y el grosor de la mielina¹. La señalización sensorial desde la periferia hasta el sistema nervioso central (SNC) se basa en la activación de neuronas sensoriales de primer orden que residen en agrandamientos de la raíz dorsal, denominados ganglios de la raíz dorsal (GRD). Para la formación y el mantenimiento de la mielina, la comunicación continua entre los axones y las células de Schwann, que son las células gliales mielinizantes en el SNP, es obligatoria².

Muchas enfermedades del SNP perturban la transducción de información por daño axonal primario o desmielinizante, lo que resulta en hipestesia o disestesia. Las neuronas sensoriales de primer orden tienen la capacidad de regenerarse en cierta medida después del daño neuronal, por una interacción compleja entre la neurona y las células de Schwann circundantes³. En este caso, las células de Schwann pueden someterse a una reprogramación celular para eliminar los desechos axonales y de mielina y promover la regeneración axonal, lo que resulta en la remielinización⁴. Comprender los mecanismos de mielinización en la salud y la enfermedad es importante, con el fin de encontrar posibles opciones de tratamiento para los trastornos desmielinizantes de la SNP. La mielina también puede ser dañada por neurotrauma agudo, y los enfoques para promover la mielinización para avanzar en la recuperación funcional después de la lesión del nervio periférico están bajo investigación⁵.

Nuestro conocimiento de la mielinización periférica se ha beneficiado en gran medida de los cocultivos mielinizantes de células de Schwann y neuronas sensoriales. Desde que se aplicaron los primeros abordajes ^6,7,8, la mielinización ha sido intensamente estudiada con el uso de diferentes sistemas de cocultivo^9,10,11. Aquí, proporcionamos un protocolo rápido y fácil para la mielinización in vitro robusta de los axones ganglionares de la raíz dorsal. El protocolo para la preparación de células de Schwann se basa en el protocolo de Andersen et al.12, publicado previamente en Pitarokoili et ^al.13. Utilizamos células de Schwann derivadas de ratas jóvenes y cultivos embrionarios de explante DRG para el cocultivo, en el que la mielinización ocurre alrededor del día 14. El objetivo del método es proporcionar un sistema para investigar la formación de mielina como resultado de la interacción directa axón-célula de Schwann, y estudiar los moduladores de la mielinización del SNP. En comparación con los cultivos celulares neuronales disociados, los explantes de DRG se conservan más anatómicamente y forman procesos axonales largos. La cuantificación del área del axón mielinizado proporciona una lectura suficiente para la mielinización en el cocultivo. El método es una herramienta valiosa para detectar compuestos terapéuticos por su efecto potencial sobre la mielinización del SNP, y también puede ser utilizado además de estudios in vivo en modelos animales¹⁴.

Protocol

Todos los procedimientos se realizaron de conformidad con la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas para el cuidado y uso de animales de laboratorio. 1. Cultivo celular de Schwann Recubrimiento para cultivo celular de SchwannCubra las placas de cultivo celular en condiciones estériles. Aplicar 2 ml de poli-L-lisina (PLL) al 0,01% en dos placas de cultivo de tejidos (CT) de 60 mm cada una e incubar durante la noche a 4 °C. Retirar el PL…

Representative Results

La mielinización en el cocultivo se evaluó en los días 10, 12, 14, 16, 18 y 20. Los explantes de DRG y las células de Schwann se tiñeron para MBP, βIII-tubulina y DAPI. La red axonal en el cocultivo fue densa y no cambió visiblemente en el curso temporal de la observación. Los primeros signos de mielina, en forma de pequeños fragmentos, fueron detectables el día 10 y aumentaron el día 12 (Figura 2). Las áreas positivas para MBP aumentaron con el tiempo hasta el día 20 de cultura…

Discussion

Aquí, presentamos un protocolo rápido y fácil para la generación de mielinización in vitro mediante la fusión de dos cultivos de tipo celular separados, células de Schwann y explantes ganglionares de la raíz dorsal.

Un paso crítico del protocolo es el cultivo de explantes DRG, especialmente en los primeros días de cultivo. Los DRG son muy frágiles antes de que se construya una red axonal fuerte y deben manejarse con mucho cuidado, por ejemplo, cuando se sacan de la incubado…

Materials

Anti-MBP, rabbit	Novus Biologicals, Centannial, USA	ABIN446360
Anti-ßIII-tubulin, mouse	Biolegend, San Diego, USA	657402
Ascorbic acid	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	A4403-100MG
B27-supplement	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	17504-044
Biosphere Filter Tip, 100 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	70760212
Biosphere Filter Tip, 1250 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	701186210
Biosphere Filter Tip, 20 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	701114210
Biosphere Filter Tip, 300 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	70765210
Bovine serum albumin	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	8076.4
Cell strainer, 100 µM	BD Bioscience, Heidelberg, Germany	352360
Centrifuge 5810-R	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	5811000015
CO2 Incubator Heracell	Heraeus Instruments, Hanau, Germany	51017865
Coverslips 12 mm	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	P231.1
Curved fine forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11370-42
DAPI fluoromount-G(R)	Biozol, Eching, Germany	SBA-0100-20
Dispase II	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	4942078001
Distilled water (Water Purification System)	Millipore, Molsheim, France	ZLXS5010Y
DMEM/F-12, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	31331093
DPBS (no Ca2+ and no Mg2+)	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	D8537-6X500ML
Ethanol	VWR, Radnor, USA	1009862500
FCS	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	F7524	FCS must be tested for Schwann cell culture
Fine forceps (Dumont #5)	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11252-20
Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11370-40
Forskolin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	F6886-10MG
Gelatin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	G1393-20ML
Gentamycin	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	5710064
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	A11036
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	A11001
HBSS (no Ca2+ and no Mg2+)	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	14170138
HERAcell Incubator	Heraeus Instruments, Hanau, Germany	51017865
Heraguard ECO 1.2	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	51029882
Horse serum	Pan-Biotech, Aidenbach, Germany	P30-0712
Image J Software	HIH, Bethesda, USA
Laminin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	L2020-1MG
Leibovitz´s L-15 Medium	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	11415064
L-Glutamine 200 mM	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	25030024
MACS Multistand	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130042303
Microscissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	15000-08
Microscope	Motic, Wetzlar, Germany	Motic BA 400
Microscope Axio observer 7	Zeiss, Oberkochen, Germany	491917-0001-000
Microscope slide	VWR, Radnor, USA	630-1985
MiniMACS separator	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130091632
MS columns	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-201
Neubauer counting chamber	Assistant, Erlangen, Germany	40441
Neuregulin	Peprotech, Rocky Hill, USA	100-03
Neurobasal medium	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	21103049
NGF	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	N1408
Normal goat serum	Biozol, Eching, Germany	S-1000
Nunclon Δ multidishes, 4 well	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	D6789
Paraformaldehyde	Acros Organics, New Jersey, USA	10342243
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15140-122
Pipetboy	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	4430000018
Pipettes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	2231300004
Poly-D-Lysin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	P6407-5MG
Poly-L-Lysin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	P4707-50ML
Reaction tubes, 15 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	62554502
Reaction tubes, 50 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	62547254
Reaction vessels, 1.5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	72690001
Safety Cabinet S2020 1.8	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	51026640
Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14083-08
Serological pipette, 10 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861254025
Serological pipette, 25 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861685001
Serological pipette, 5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861253001
Spatula	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	10094-13
Stereomicroscope Discovery.V8	Zeiss, Oberkochen, Germany	495015-0012-000
Surgical scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14007-14
TC dish 100, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833902300
TC dish 35, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833900300
TC dish 60, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833901300
Thy-1 Microbeads (MACS Kit)	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-094-523
Triton X-100	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	X100-500ML
Trypan Blue Solution 0.4%	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15250061
Trypsin (2.5%), no phenol red	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15090-046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	25300-054
Type I Collagenase	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	C1639
Water bath type 1008	GFL, Burgwedel, Germany	4285